1{S] Km+[s ∴K 由此可以看出Km值的物理意义,即Km值是当酶反应速度达到最大反应速度一半时 的底物浓度,它的单位是mo/L,与底物浓度的单位一样 米氏常数是酶学研究中的一个极重要的数据,关于Km还可作以下几点分析: (1)Km值是酶的特征常数之一,一般只与酶的性质有关,而与酶的浓度无关。不 同的酶K.值不同。 (2)如果一个酶有几种底物,则该酶对每一种底物都有一个特定的Km值(表5-3) 并且Km值还受pH值及温度的影响。因此,Kn值作为常数只是对一定的底物、一定的 H值、一定的温度条件而言的。测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段,但是必须 在指定的实验条件下进行。 表5-3一些酶的κ值 过氧化氢酶(ctae) 尿素 己糖激酶( hexokinase) 葡萄糖 蔗糖 棉子糖 胰凝乳蛋白酶 chymotrypsin) N-苯甲酰酪氨酰胺 N甲酰酪氨酰胺 N-乙酰酪氨酰胺 甘氨酰酪氨酰胺 HCO3 谷氨酸脱氢酶( glutamate dehydrogenase 谷氨酸 0.12 a酮戊二酸 NAD+攪 肌酸激酶( creatine kirmse) ADP 乳酸脱氢酶( actate dehydrogenase) 0.017 丙酮酸脱氢酶( pyruvate dehydrogenase) 葡萄糖一6-磷酸脱氢( glucosyl6- phosphate dehydrogenase) 6-磷酸-葡萄糖 0.058 磷酸己糖异构酶( hexose6- hosphate isomerase) 6-磷酸-葡萄糖
105 l [S] ＝ ───── 2 Km + [S] ∴Km ＝ [S] 由此可以看出 Km 值的物理意义，即 Km 值是当酶反应速度达到最大反应速度一半时 的底物浓度，它的单位是 mol/L，与底物浓度的单位一样。 米氏常数是酶学研究中的一个极重要的数据，关于 Km 还可作以下几点分析： (l)• Km 值是酶的特征常数之一，一般只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。不 同的酶 Km 值不同。 (2)如果一个酶有几种底物，则该酶对每一种底物都有一个特定的 Km 值(表 5-3)。 并且 Km 值还受 pH 值及温度的影响。因此,Km 值作为常数只是对一定的底物、一定的 pH 值、一定的温度条件而言的。测定酶的 Km 值可以作为鉴别酶的一种手段，但是必须 在指定的实验条件下进行。 表 5-3 一些酶的 Km 值 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 酶 底 物 K m(mmol/L) ───────────────────────────────────────────────── 过氧化氢酶(catase) H2O2 25 脲酶(urease) 尿素 25 己糖激酶(hexokinase) 葡萄糖 0.15 果糖 1.5 蔗糖酶(sacchrase) 蔗糖 28 棉子糖 350 胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin) N-苯甲酰酪氨酰胺 2.5 N-甲酰酪氨酰胺 12.0 N-乙酰酪氨酰胺 32.0 甘氨酰酪氨酰胺 122.0 碳酸酐酶(carbinic anhydrase) HCO3 - 8.0～9.0 谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase) 谷氨酸 0.12 α-酮戊二酸 2.0 NAD 攩+攪 0.025 NADH 0.018 肌酸激酶(creatine kinase) 肌酸 0.6 ADP 19.0 磷酸肌酸 5.0 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase) 丙酮酸 0.017 丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase) 丙酮酸 1.3 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucosyl-6-phosphate dehydrogenase) 6-磷酸-葡萄糖 0.058 磷酸己糖异构酶(hexose-6-phosphate isomerase) 6-磷酸-葡萄糖 0.7
B-半乳糖苷酸( B-galactosdase) 溶菌酶( lysozyme) 6-N-乙酰-葡萄糖 丙酮酸羧化酶( pyruvate carboxylase HCO擋-攪 精氨酸RNA合成剩( argirne-tRNA-synthetase) 精氨酸 ATP (3)1/Km近似地表示酶对底物亲和力的大小,MKm愈大,表明亲和力越大,因为VKn 愈大,Kn值就愈小,达到最大反应速度一半所需要的底物浓度就愈小。显然,最适底物 与酶的亲和力最大,不需很高的底物浓度就可以很容易地达到lax 测定Km值有许多种方法,最常用的是 Lineweaver-Buk的双倒数作图法。求 Michaelis-Menten方程的倒数,可得下式: 此方程相当于一直线的数学表达:y=ax+b,以M/V为纵坐标,1S为横坐标,将数据 作图,则得一直线,其斜率为Km/Vm,将直线延长,在S]及V上的截矩分别为 l/Km及1/Wmax,这样Km就可以从直线上的截矩计算出来图5-2)。 图5-2双倒数作图法,以1N对1/S]作图求Km 二、pH值对酶促反应速度的影响 大部分酶的活力受其环境pH值的影响,在一定pH值下,酶促反应具有最大速 度,高于或低于此值,反应速度下降,通 常称此pH值为酶促反应的最适pH值 (optimum pH) 最适p值有时因底物种类、浓度及 缓冲液成分不同而不同,而且常与酶的等 电点不一致,因此,酶的最适pH值并不 最适pH值 图5-3pH值对酶活性的影响
106 β-半乳糖苷酶(β-galactosidase) 乳糖 4.0 溶菌酶(lysozyme) 6-N-乙酰-葡萄糖 0.006 丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase) 丙酮酸 0.4 HCO 攩-攪 1.0 ATP 0.06 精氨酸-tRNA 合成酶(argirine-tRNA-synthetase) 精氨酸 0.003 tRNA 0.0004 ATP 0.3 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ (3)•1/Km 近似地表示酶对底物亲和力的大小，l/Km 愈大,表明亲和力越大,因为 l/Km 愈大，Km 值就愈小，达到最大反应速度一半所需要的底物浓度就愈小。显然，最适底物 与酶的亲和力最大，不需很高的底物浓度就可以很容易地达到 Vmax 。 测定 Km 值有许多种方法， 最常用的是 Lineweaver-Burk 的双倒数作图法。求 Michaelis-Menten 方程的倒数，可得下式： 1 Km 1 1 ─ ＝ ── × ── ＋ ── V Vmax [S] Vmax 此方程相当于一直线的数学表达： y＝ax+b，以 1/ V 为纵坐标，1/[S]为横坐标，将数据 作图，则得一直线， 其斜率为 Km/ Vmax ，将直线延长， 在 1/[S]及 1/ V 上的截矩分别为 -1/ Km及 1/Vmax，这样 Km就可以从直线上的截矩计算出来(图5-2)。 1/V 1/Vmax －1/Km 1/[S] 斜率= Km /Vmax 图 5-2 双倒数作图法，以1/V 对1/[S]作图求 Km 二、 pH 值对酶促反应速度的影响 大部分酶的活力受其环境 pH 值的影响，在一定 pH 值下，酶促反应具有最大速 度，高于或低于此值，反应速度下降，通 常称此 pH 值为酶促反应的最适 pH 值 (optimum pH)。 最适 pH 值有时因底物种类、浓度及 缓冲液成分不同而不同，而且常与酶的等 电点不一致，因此，酶的最适 pH 值并不 图 5-3 pH 值对酶活性的影响 最适pH值 pH值 反 应 速 度 V
是一个常数,只是在一定条件下才有意义。几种酶的最适pH值见表54。一般在pH值 6~8之间,动物酶多在pH值65~80之间,植物及微生物酶多在pH值45~65之间,但 也有例外,如胃蛋白酶为1.5。 pH值影响酶活力的原因可能有以下几个方面 鸡蛋清蛋 丙酸羧化酶( pyruvate carboxylase 丙酮酸 脲 6.4~69 胰a-淀粉酶(a- amylase) 淀粉 6.7~72 麦芽β-淀粉酾β- amuse) 淀粉 延胡索酸 fumarase) 延胡索酸 苹果酸 胰蛋白 ( trypsin) 蛋白质 精氨酸酸 arginase 精氨酸 95~9.7 (1)pH值会影响酶蛋白的构象,影响酶分子的稳定性。一般来说,酶在最适pH 值时是稳定的过酸或过碱都能引起蛋白质变性而使酶失去活性 (2)pH值能影响酶分子的解高状态。因为酶是蛋白质,pH值的变化会影响到蛋白 质上的许多极性基团(如氨基、羧基、咪唑基、巯基等)的离子特性。在不同pH值条件 下,这些基团解离的状态不同,所带电荷也不同,只有在酶蛋白处于一定解离状态下,才 能与底物形成中间物,而且酶的解离状态也影响酶的活性。例如,胃蛋白酶在正离子状态 下有活性:胰蛋白酶在负离子状态下有活性:而蔗糖酶在两性离子状态下才具有活性。 表5-4几种酶的最适pH值 (3)pH值影响底物的解高许多底物或辅酶也具有离子特性(如APP、NAD、 CoA等),pH值的变化也影响它们的解离状态。而酶只与某种解离状态的底物才形成复合 物,如在p值90~10.0时,精氨酸解离成正离子,而精氨酸酶解离成负离子,此时酶 的活性最大。 、温度对繭促反应速度的影响 温度对酶促反应速度用Ⅴ表示也有很大影响, 如图54所示,有一个最适温度(opim temperature)。最适温度两侧,反应速度都比较低 在达到最适温度之前提高温度,可以提高酶促反应的 速度。反应温度提高10℃,其反应速度与原来的反 应速度之比称为反应温度系数,用Qo表示。对于许 多酶来说,Q0多为1~2 也就是说,温度每增高10℃,酶促反应速度为 最适温度 图5-4温度与酶促反应速度的关系
107 是一个常数，只是在一定条件下才有意义。几种酶的最适 pH 值见表 5-4。一般在 pH 值 6～8 之间, 动物酶多在 pH 值 6.5～8.0 之间,植物及微生物酶多在 pH 值 4.5～6.5 之间，但 也有例外，如胃蛋白酶为 1.5。 pH 值影响酶活力的原因可能有以下几个方面： （1）pH 值会影响酶蛋白的构象， 影响酶分子的稳定性。一般来说，酶在最适 pH 值时是稳定的,过酸或过碱都能引起蛋白质变性而使酶失去活性。 （2）pH 值能影响酶分子的解离状态。因为酶是蛋白质，pH 值的变化会影响到蛋白 质上的许多极性基团(如氨基、羧基、咪唑基、巯基等)的离子特性。在不同 pH 值条件 下，这些基团解离的状态不同，所带电荷也不同，只有在酶蛋白处于一定解离状态下，才 能与底物形成中间物，而且酶的解离状态也影响酶的活性。例如，胃蛋白酶在正离子状态 下有活性；胰蛋白酶在负离子状态下有活性；而蔗糖酶在两性离子状态下才具有活性。 表 5-4 几种酶的最适pH 值 （3）pH 值影响底物的解离 许多底物或辅酶也具有离子特性(如 ATP、NAD+、 CoA 等)，pH 值的变化也影响它们的解离状态。而酶只与某种解离状态的底物才形成复合 物，如在 pH 值 9.0～10.0 时，精氨酸解离成正离子，而精氨酸酶解离成负离子，此时酶 的活性最大。 三、温度对酶促反应速度的影响 温度对酶促反应速度(用 V 表示)也有很大影响， 如 图 5-4 所 示 ， 有 一 个 最 适 温 度 (optimum temperature)。最适温度两侧，反应速度都比较低。 在达到最适温度之前提高温度，可以提高酶促反应的 速度。反应温度提高 10℃，其反应速度与原来的反 应速度之比称为反应温度系数，用 Q10 表示。对于许 多酶来说，Q10 多为 l～2。 也就是说，温度每增高 10℃，酶促反应速度为 酶 底 物 最 适 pH 值 胃蛋白酶(pepsin) 鸡蛋清蛋白 1.5 丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase) 丙酮酸 4.8 脲酶(urease) 脲 6.4～6.9 胰α-淀粉酶(α-amylase) 淀粉 6.7～7.2 麦芽β-淀粉酶(β-amylase) 淀粉 4.5 延胡索酸酶(fumarase) 延胡索酸 6.5 苹果酸 8.0 胰蛋白酶(trypsin) 蛋白质 7.8 精氨酸酶(arginase) 精氨酸 9.5～9.7 图 5-4 温度与酶促反应速度的关系
原反应速度的1~2倍。 温度对酶促反应速度的影响有两方面原因:一是当温度升高时,反应速度加快,这与 般化学反应一样;二是随温度升高而使酶逐步变性,即通过减少有活性的酶而降低酶促 反应的速度。酶促反应的最适温度就是这两种过程平衡的结果。在低于最适温度时,以前 一种效应为主;在高于最适温度时,则以后一种效应为主,因而酶活性迅速丧失,反应速 度很快下降。大部分酶在60℃以上变性,少数酶能耐受较高的温度,如细菌淀粉酶在 93℃时活力最高。最适温度不是酶的特征性物理常数,而是上述影响的综合结果,它不是 个固定值,而与酶作用时间的长短有关。酶可以在短时间内耐受较高的温度,只有当酶 反应时间在已经规定了的情况下,才有最适温度。 四、酶浓度对酶促反应速度的影响 在一定条件下酶促反应的速度与酶的浓度成正比。因 为酶催化反应时,首先要与底物形成一中间产物,即酶 底物复合物。当底物浓度大大超过酶浓度时,反应达到 最大速度。如果此时增加酶的浓度可增加反应速度,酶促 反应速度与酶浓度成正比关系。图5-5表示酶反应速度与 酶浓度成直线关系 图5-5酶浓度对反应速度的影响 五、激活剂对促反应速度的影响 凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂 activitα,其中大部分是离子或简单有机化合 物。 激活剂按分子的大小可分为以下三类: 1.无机离子无机离子可分为三种 (1)金属离子金属离子对酶的作用有两种:一是作为酶的辅助因子起作用;二是 作为激活剂起作用。作为激活剂起作用的有K+、Na、Mg2、Zm2+、Fe及Ca等离 子。这些金属的原子序数在11~55之间,其中的Mg2是多种激酶及合成酶的激活剂 (2)阴离子在一般浓度下,阴离子的激活作用不明显。较突出的是动物唾液中的 淀粉酶受C激活。Br也有激活作用,但作用稍弱。 (3)氢离子氢离子对多种酶有激活作用。 2.中等大小的有机分子中等大小的有机分子可分为两种 (1)某些还原剂半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、氰化物等能激活某些酶,使酶中二 硫键还原成巯基(一SH),从而提高酶活性,木瓜蛋白酶及D甘油醛-3-磷酸脱氢酶也是如 此 (2)EDTA(乙二胺四乙酸) 它是金属螯合剂,能除去酶中的重金属杂质,从而解除重金属离子对酶的抑制作用
108 原反应速度的 l～2 倍。 温度对酶促反应速度的影响有两方面原因：一是当温度升高时，反应速度加快，这与 一般化学反应一样；二是随温度升高而使酶逐步变性，即通过减少有活性的酶而降低酶促 反应的速度。酶促反应的最适温度就是这两种过程平衡的结果。在低于最适温度时，以前 一种效应为主；在高于最适温度时，则以后一种效应为主，因而酶活性迅速丧失，反应速 度很快下降。大部分酶在 60℃以上变性，少数酶能耐受较高的温度，如细菌淀粉酶在 93℃时活力最高。最适温度不是酶的特征性物理常数，而是上述影响的综合结果，它不是 一个固定值，而与酶作用时间的长短有关。酶可以在短时间内耐受较高的温度，只有当酶 反应时间在已经规定了的情况下，才有最适温度。 四、酶浓度对酶促反应速度的影响 在一定条件下酶促反应的速度与酶的浓度成正比。因 为酶催化反应时，首先要与底物形成一中间产物，即酶- 底物复合物。 当底物浓度大大超过酶浓度时，反应达到 最大速度。如果此时增加酶的浓度可增加反应速度，酶促 反应速度与酶浓度成正比关系。图 5-5 表示酶反应速度与 酶浓度成直线关系。 五、激活剂对酶促反应速度的影响 凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂(activitor)，其中大部分是离子或简单有机化合 物。 激活剂按分子的大小可分为以下三类： 1．无机离子 无机离子可分为三种： （1）金属离子 金属离子对酶的作用有两种：一是作为酶的辅助因子起作用；二是 作为激活剂起作用。作为激活剂起作用的有 K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+及 Ca2+等离 子。这些金属的原子序数在 11～55 之间，其中的 Mg2+是多种激酶及合成酶的激活剂。 （2）阴离子 在一般浓度下， 阴离子的激活作用不明显。较突出的是动物唾液中的 α-淀粉酶受 Cl-激活。Br-也有激活作用，但作用稍弱。 （3）氢离子 氢离子对多种酶有激活作用。 2．中等大小的有机分子 中等大小的有机分子可分为两种： （1）某些还原剂 半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、氰化物等能激活某些酶，使酶中二 硫键还原成巯基(－SH)，从而提高酶活性，木瓜蛋白酶及 D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶也是如 此。 （2）EDTA(乙二胺四乙酸) 它是金属螯合剂，能除去酶中的重金属杂质，从而解除重金属离子对酶的抑制作用。 图 5-5 酶浓度对反应速度的影响 酶浓度 反 应 速 度
3.具有蛋白质性质的大分子物质 这类激活剂是指可对某些无活性的酶原起作用的物质。 无活性的酶原激活作用 有活性的酶 六、抑制剂对促反应速度的影响 许多化合物能与一定的酶进行可逆或不可逆的结合而使酶的催化作用受到抑制这种 化合物称为抑制剂( Inhibitor),如药物、抗生素、毒物、抗代谢物等。酶的抑制作用可以 分为两大类,即可逆性抑制(包括竞争性抑制、非竞争性抑制和不可逆抑制 1.可逆性抑制 (1)竞争性抑制作用( ompetitive inhibition)某些化合物,特别是那些在结构上与 天然底物相似的化合物可以与酶的活性中心可逆地结合,因此在反应中抑制剂可与底物竞 争同一部位。在酶促反应中酶与底物形成酶一底物复合物ES,抑制剂则与酶结合形成酶 抑制剂复合物 E+S ES P+E 式中:I抑制剂:E酶-抑制剂复合物;P一产物 但是酶一抑制剂复合物不能再与底物生成ES,但EI的形成是可逆的,并且底物和 抑制剂不断竞争酶分子上的活性中心。这种情况称为竞争性抑制作用( competitive inhibition)。竞争性抑制作用可以通过增加底物浓度基本消除。竞争性抑制作用的典型例 子为琥珀酸脱氢酶( cinate dehydrogenase)。当有适当的氢受体(A)时,此酶催化下列反 COOH OH CH +AH, COOH COOH 琥珀酸+受体=反丁烯二酸+还原性受体 许多结构与琥珀酸结构相似的化合物都能与琥珀酸脱氢酶结合,但不脱氢,这些化 合物阻塞了酶的活性中心,因而抑制正常反应的进行。抑制琥珀酸脱氢酶的化合物有乙二 酸、丙二酸、戊二酸等,其中抑制作用最强的是丙二酸,当抑制剂和底物的浓度比为 50时,酶活性被抑制50%
109 3．具有蛋白质性质的大分子物质 这类激活剂是指可对某些无活性的酶原起作用的物质。 激活作用 无活性的酶原────→有活性的酶 六、抑制剂对酶促反应速度的影响 许多化合物能与一定的酶进行可逆或不可逆的结合,而使酶的催化作用受到抑制,这种 化合物称为抑制剂(Inhibitor)，如药物、抗生素、毒物、抗代谢物等。酶的抑制作用可以 分为两大类，即可逆性抑制(包括竞争性抑制、非竞争性抑制)和不可逆抑制。 1．可逆性抑制 （1）竞争性抑制作用(competitive inhibition) 某些化合物，特别是那些在结构上与 天然底物相似的化合物可以与酶的活性中心可逆地结合，因此在反应中抑制剂可与底物竞 争同一部位。在酶促反应中酶与底物形成酶－底物复合物 ES，抑制剂则与酶结合形成酶 —抑制剂复合物： E + S + P+E I EI ES 式中：I——抑制剂；EI——酶-抑制剂复合物；P——产物。 但是酶－抑制剂复合物不能再与底物生成 EIS，但 EI 的形成是可逆的，并且底物和 抑制剂不断竞争酶分子上的活性中心。这种情况称为竞争性抑制作用(competitive inhibition)。竞争性抑制作用可以通过增加底物浓度基本消除。竞争性抑制作用的典型例 子为琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)。当有适当的氢受体(A)时，此酶催化下列反 应： COOH CH2 CH2 COOH 琥珀酸 + 受体 = 反丁烯二酸 + 还原性受体 + A + AH2 COOH CH C COOH H 许多结构与琥珀酸结构相似的化合物都能与琥珀酸脱氢酶结合，但不脱氢，这些化 合物阻塞了酶的活性中心，因而抑制正常反应的进行。抑制琥珀酸脱氢酶的化合物有乙二 酸、丙二酸、戊二酸等，其中抑制作用最强的是丙二酸，当抑制剂和底物的浓度比为 1:50 时，酶活性被抑制50％