)具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建 Bloch最早证实细胞内的GSH是由γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH-I,EC6,3,2.2)与谷胱甘 肽合成酶( GSH-Il,EC6.323)在ATP存在下催化L谷氨酸(Gu)、L-半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly) 的一个序贯反应合成的。要实现GSH的高效合成,GSH合成酶系的高活性和ATP的有效供给 是两个必须满足的条件。重组大肠杆菌wsH-KE1能以葡萄糖为底物在胞内积累GSH。虽然 可以实现该菌株的高密度培养,但由于质粒的不稳定性,使得该菌株在高密度培养过程中胞 内GSH合成能力明显下降 在经过细胞通透性处理之后,重组大肠杆菌 WSH-KE能够以L-Glu,LCys和Gly为底物, 在胞外积累1g/L左右的GSH。然而,在该菌株中,质粒稳定性极差。考虑到工程菌中外来 基因的表达既受基因本身的影响,也受宿主细胞遗传及生理特性的影响,为此,我们改变宿 主细胞,试图构建一株GSH合成活性和质粒稳定性俱佳的重组大肠杆菌。在此基础上,对新 构建菌株生物合成GSH的反应过程进行了研究 质粒pGH501的提取和大肠杆菌转化 携带质粒pGH501的重组E. coli wsh-KE1能够以葡萄糖为底物胞内积累GSH,然而在高 密度培养条件下质粒容易丢失。Aiba等和 Skogman等认为,质粒的稳定性会受到宿主细胞遗 传特性、质粒的拷贝数以及质粒上基因的表达等诸多因素的影响。因此,更换质粒pGH501 的宿主细胞,有可能构建出一株GSH合成活性和质粒稳定性俱佳的重组大肠杆菌 首先从重组E. coli wsh-Ke1中提取质粒pGH501,然后分别以E. coli dh5a、E.col JM09、E.colI和Ecol.宿主进行转化,以氨苄青霉素抗性(Amp为选择性标记挑取转 化子。在所得到的不同宿主的转化子中,各选取10个生长情况良好的单菌落,考察其GSH 合成能力。结果发现,新构建的转化子中,80%以上其GSH合成能力较出发菌株有所提高 表3-2-1给出了部分转化子的GSH合成活性比较。根据初筛结果,从不同宿主细胞中分别选 取GSH合成能力最强的4株菌进行复筛,结果以E. coliN5a和E. colijN109为宿主细胞获得的 转化子,其GSH合成能力明显下降(甚至低于出发菌株),而以野生型大肠杆菌为宿主细胞获 得的转化子E. coli I-2和 E. coliⅡ-1,却仍能保持很强的GSH合成活性。分别从这两个转化子 中提取质粒,琼脂糖凝胶电泳证实质粒pGH501已成功转入
11 (一)具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建 Bloch最早证实细胞内的GSH是由-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH-I，EC6.3.2.2)与谷胱甘 肽合成酶(GSH-II，EC6.3.2.3)在ATP存在下催化L-谷氨酸(Glu)、L-半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly) 的一个序贯反应合成的。要实现GSH的高效合成，GSH合成酶系的高活性和ATP的有效供给 是两个必须满足的条件。重组大肠杆菌WSH-KE1能以葡萄糖为底物在胞内积累GSH。虽然 可以实现该菌株的高密度培养，但由于质粒的不稳定性，使得该菌株在高密度培养过程中胞 内GSH合成能力明显下降。 在经过细胞通透性处理之后，重组大肠杆菌WSH-KE1能够以L-Glu，L-Cys和Gly为底物， 在胞外积累1 g/L左右的GSH。然而，在该菌株中，质粒稳定性极差。考虑到工程菌中外来 基因的表达既受基因本身的影响，也受宿主细胞遗传及生理特性的影响，为此，我们改变宿 主细胞，试图构建一株GSH合成活性和质粒稳定性俱佳的重组大肠杆菌。在此基础上，对新 构建菌株生物合成GSH的反应过程进行了研究。 1、质粒pGH501的提取和大肠杆菌转化 携带质粒pGH501的重组E. coli WSH-KE1能够以葡萄糖为底物胞内积累GSH，然而在高 密度培养条件下质粒容易丢失。Aiba等和Skogman等认为，质粒的稳定性会受到宿主细胞遗 传特性、质粒的拷贝数以及质粒上基因的表达等诸多因素的影响。因此，更换质粒pGH501 的宿主细胞，有可能构建出一株GSH合成活性和质粒稳定性俱佳的重组大肠杆菌。 首先从重组E. coli WSH-KE1中提取质粒pGH501，然后分别以E. coli DH5、E. coli JM109、E. coliⅠ和E. coliⅡ为宿主进行转化，以氨苄青霉素抗性(Ampr )为选择性标记挑取转 化子。在所得到的不同宿主的转化子中，各选取10个生长情况良好的单菌落，考察其GSH 合成能力。结果发现，新构建的转化子中，80%以上其GSH合成能力较出发菌株有所提高。 表3-2-1给出了部分转化子的GSH合成活性比较。根据初筛结果，从不同宿主细胞中分别选 取GSH合成能力最强的4株菌进行复筛，结果以E. coliDH5和E. coliJM109为宿主细胞获得的 转化子，其GSH合成能力明显下降(甚至低于出发菌株)，而以野生型大肠杆菌为宿主细胞获 得的转化子E. coliⅠ-2和E. coliⅡ-1，却仍能保持很强的GSH合成活性。分别从这两个转化子 中提取质粒，琼脂糖凝胶电泳证实质粒pGH501已成功转入
表3-2-1部分新构建的转化子GSH合成活性比轧 转化子 初筛 复筛 GSH浓度比原菌提高GSH浓度/(g)比原菌提高 WSH-KEI 1.03 1.03 E. colil-2 3.98 3.84 E. colil-8 1.86 E. coliI-9 2 19 E. colill-I 4.25 E. colilI-5 e. colill-6 E. colilI-10 2.45 DHSa-1 1.54 50 0.76 DH5a-2 1.28 DHSa-6 DHSa-9 JM109-3 3.31 0.64 JM109-4 2.94 JM109-9 JM109-10 1.23 *大肠杆菌 E. coli DH5a、 E coli JM109、E.col和E.col合成GSH的能力均小于02gL 2、新构建菌株的质粒稳定性 出发菌株E. coli wsh-KEl的最大缺陷即为质粒稳定性差。表3-2-2显示,新构建的转化 子E.col-2和E.col-1,其质粒稳定性比E. coli wsh-KEI明显提高。综合考虑GSH合成活 性与质粒稳定性这两个因素,选取E.coMl1l为进一步研究的对象。 表3-2-2不同转化子质粒稳定性的比较 菌株 LAmp平板中菌落数/mLLB平板中菌落数/mL质粒丢失率/% E. coli 1-2 50×107 1.0×108 E. coli II-1 9.1×108 1.9×109 E. coli 3.3×10 4.6×108 WSH-KEl *质粒丢失率=(LB平板菌落数一LAmp平板菌落数)/LB平板菌落数×100% 3、E. coli l-1的遗传稳定性 将 E conill-用LAmp斜面连续转接5代,测定每一代的GSH合成能力。结果发现E.col-1 连续传接5代后GSH合成能力并无明显下降(图3-2-3)
12 表3-2-1 部分新构建的转化子GSH合成活性比较* 转化子 初筛 复筛 GSH浓度 / (g/L) 比原菌提高 (%) GSH浓度/ (g/L) 比原菌提高 (%) WSH-KE1 1.03 1.03 E. coliI-2 3.98 288 3.84 273 E. coliI-4 2.63 156 E. coliI-8 1.86 81 E. coliI-9 1.22 19 E. coliII-1 4.25 313 4.17 306 E. coliII-5 2.73 166 E. coliII-6 2.54 147 E. coliII-10 2.45 138 DH5a-1 1.54 50 0.76 -26 DH5a-2 1.28 25 DH5a-6 0.68 -34 DH5a-9 0.63 -39 JM109-3 3.31 222 0.64 -38 JM109-4 2.94 186 JM109-9 1.46 42 JM109-10 1.23 20 * 大肠杆菌E. coli DH5a、E. coli JM109、E. coliI和E. coliII合成GSH的能力均小于0.2g/L。 2、新构建菌株的质粒稳定性 出发菌株E. coli WSH-KE1的最大缺陷即为质粒稳定性差。表3-2-2显示，新构建的转化 子E. coliI-2和E. coliII-1，其质粒稳定性比E. coli WSH-KE1明显提高。综合考虑GSH合成活 性与质粒稳定性这两个因素，选取E. coliII-1为进一步研究的对象。 表3-2-2 不同转化子质粒稳定性的比较* 菌株 LAmp平板中菌落数/ mL LB平板中菌落数/ mL 质粒丢失率/ % E. coli I-2 5.0×107 1.0×108 50 E. coli II-1 9.1×108 1.9×109 52 E. coli WSH-KE1 3.3×106 4.6×108 99 * 质粒丢失率= (LB平板菌落数－LAmp平板菌落数) / LB平板菌落数×100% 3、E. coli II-1的遗传稳定性 将E. coliII-1用LAmp斜面连续转接5代，测定每一代的GSH合成能力。结果发现E. coliII-1 连续传接5代后GSH合成能力并无明显下降(图3-2-3)
传代数 Generations 图3-23传代数对E.cohl1-1合成GSH的影响 4、E. coli l-中GSH合成酶系的稳定性 如图3-2-4所示,E. coliWSH-KE1细胞重复使用4次后,GSH合成活性就已降至初始活性 的20%:而E.coll-1细胞重复使用4次后,GSH的合成活性仍能保持初始活性的90%以上 5432 重复使用次数 Repeated- use times 图3-24重复使用次数对不同菌株GSH合成活性的影响 ●EcolⅡ-1:OE. coli wsi-KEl 以上实验结果表明,以野生型大肠杆菌为宿主细胞,成功地构建得到了一株既有很高的 GSH合成活性,又有很强的质粒稳定性和传代稳定性,并且能够重复使用的重组大肠杆菌 E.coli-1,该菌株具有潜在的工业应用价值。 (二)E.coliⅡ-合成GSH的反应过程 1、有机溶剂处理对E. coli ll-1合成GSH的影响 如表3-2-3所示,若细胞未经有机溶剂处理,则几乎不能在胞外积累GSH。而经过一定 浓度的甲苯、苯乙醇和甲醇处理后,胞外GSH浓度明显提高,其中又以甲苯的效果最好。这 些有机溶剂的作用在于提高了细胞膜的通透性,使ATP、其它底物及产物能够自由出入细胞, 从而促进了GSH合成反应的进行。 表3-2-3有机溶剂处理对E.col-1合成GSH的影响 有机溶剂 无10%甲苯丙酮10%苯乙醇7%丁醇10%甲醇 GSH浓度/gL0.144.1 2.56 1.37 2、前体氨基酸对E. coli ll1l合成GSH的影响 不同浓度的LGlu、LCys和Gly对E.col-1合成GSH的影响如图3-2-5所示。LCy浓度 增大到20mmo/L就会使GSH产量降低,可能是因为LCys对GSH的抑制作用。业已发现 当反应体系中LCys浓度达到60mmo时,GSH的活性降低到最高活性的50%。而LGlu 浓度增大到120mmo/时GSH的合成量仍在增加,很可能是因为LGu对GSH-1的活性有促
13 0 2 4 6 0 1 2 3 4 5 6 传代数 Generations c (GSH) / (g/L) 图3-2-3 传代数对E. coli II-1合成GSH的影响 4、E. coli II-1中GSH合成酶系的稳定性 如图3-2-4所示，E. coliWSH-KE1细胞重复使用4次后，GSH合成活性就已降至初始活性 的20%；而E. coliII-1细胞重复使用4次后，GSH的合成活性仍能保持初始活性的90%以上。 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 重复使用次数 Repeated-use times c (GSH) / (g/L) 图3-2-4 重复使用次数对不同菌株GSH合成活性的影响 ● E. coli Ⅱ-1；○ E. coli WSH-KE1 以上实验结果表明，以野生型大肠杆菌为宿主细胞，成功地构建得到了一株既有很高的 GSH合成活性，又有很强的质粒稳定性和传代稳定性，并且能够重复使用的重组大肠杆菌 E. coli II-1，该菌株具有潜在的工业应用价值。 (二)E. coliⅡ-1 合成 GSH 的反应过程 1、有机溶剂处理对E. coli II-1合成GSH的影响 如表3-2-3所示，若细胞未经有机溶剂处理，则几乎不能在胞外积累GSH。而经过一定 浓度的甲苯、苯乙醇和甲醇处理后，胞外GSH浓度明显提高，其中又以甲苯的效果最好。这 些有机溶剂的作用在于提高了细胞膜的通透性，使ATP、其它底物及产物能够自由出入细胞， 从而促进了GSH合成反应的进行。 表3-2-3 有机溶剂处理对E. coli II-1合成GSH的影响 有机溶剂 无 10%甲苯 丙酮 10%苯乙醇 7%丁醇 10%甲醇 GSH 浓度/ gL -1 0.14 4.1 0 2.56 0 1.37 2、前体氨基酸对E. coli II-1合成GSH的影响 不同浓度的L-Glu、L-Cys和Gly对E. coliII-1合成GSH的影响如图3-2-5所示。L-Cys浓度 增大到20 mmol/L就会使GSH产量降低，可能是因为L-Cys对GSH-I的抑制作用。业已发现， 当反应体系中L-Cys浓度达到60 mmol/L时，GSH-I的活性降低到最高活性的50%。而L-Glu 浓度增大到120 mmol/L时GSH的合成量仍在增加，很可能是因为L-Glu对GSH-I的活性有促
进作用。只有在LGu过量存在的情况下,LCys才会尽可能地转化为y-L-谷氨酰L半胱氨酸。 [。。。1 q 0 80100120015304560051015202530 c(Glu)/(mmolL c(Gly)/(mmolL) c(Cys)/(mmol/L) 图3-2-5前体氨基酸对E. coli ll1合成GSH的影响 注:Glu浓度变化时,Gl和Cys浓度分别为20mmoL和15mmoL:G浓度变化时,Gu和Cys浓度分别为 几L和15mmo:Cys浓度变化时,Gu和Gy浓度分别为60mmoM和20mmo 图3-2-6GSH合成过程曲线 ●GSH:口LGiu:△Gly: O L-Cys L-Glu、LCys和Gly浓度固定时GSH合成反应的过程曲线示于图3-2-6。理论上,每生成 1 mol gsh需要消耗各1mol的三种前体氨基酸。然而,由图3-2-6可知,当反应体系中合成了 183mmoL的GSH时,L-Cys消耗了18mmoL,但LGlu和Gl却只消耗了89mmoL和7 mmol/L。从图3-2-5也可看出,在反应体系中加入5mmOL的Gy,就能够合成4g/(约为13 mmol/L)的GSH,即底物的消耗和产物的生成不平衡。 这一现象的产生,可能是因为E.col-细胞含有较高浓度的LGu和Gly。为了证实这种 推测,将E.col-1)反复用于GSH合成反应,每次反应中均测定GSH的净增加量以及LGlu和 Gly的净减少量。结果发现(表3-2-4),Ecol-1细胞重复使用5次后,底物氨基酸的消耗量与 产物的合成量才基本达到平衡。此外,在第一次的GSH合成反应进行5min时,测定出反应 液中的LGlu和Gi的量分别为843mmol和3:8mmoL,比LGu和Gly的实际添加量分别 高出了24.3mmo和118mmol/L。这些数据充分说明,E.col-1细胞内确实含有较高浓度 的L-Glu和Gly,也可能含有少量的LCys
14 进作用。只有在L-Glu过量存在的情况下，L-Cys才会尽可能地转化为-L-谷氨酰-L-半胱氨酸。 0 1 2 3 4 5 6 0 5 10 15 20 25 30 c (Cys) / (mmol/L) c (GSH) / (g/L) 0 1 2 3 4 5 6 0 15 30 45 60 c(Gly) / (mmol/L) c (GSH) / (g/L) 0 1 2 3 4 5 6 0 20 40 60 80 100 120 c(Glu) / (mmol/L) c (GSH) / (g/L) 图3-2-5 前体氨基酸对E. coli II-1合成GSH的影响 注∶Glu浓度变化时，Gly和Cys浓度分别为20 mmol/L和15 mmol/L；Gly浓度变化时，Glu和Cys浓度分别为 60 mmol/L和15 mmol/L；Cys浓度变化时，Glu和Gly浓度分别为60 mmol/L和20 mmol/L。 0 2 0 4 0 6 0 8 0 0 1 2 3 t / h c (Gly,Glu,Cys) / (mmol/L) 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 c (GSH) / (mmol/L) 图3-2-6 GSH合成过程曲线 ● GSH；□ L-Glu；△ Gly；○ L-Cys L-Glu、L-Cys和Gly浓度固定时GSH合成反应的过程曲线示于图3-2-6。理论上，每生成 1 mol GSH需要消耗各1 mol的三种前体氨基酸。然而，由图3-2-6可知，当反应体系中合成了 18.3 mmol/L的GSH时，L-Cys消耗了18mmol/L，但L-Glu和Gly却只消耗了8.9 mmol/L和7 mmol/L。从图3-2-5也可看出，在反应体系中加入5 mmol/L的Gly，就能够合成4 g/L(约为13 mmol/L)的GSH，即底物的消耗和产物的生成不平衡。 这一现象的产生，可能是因为E. coliII-1细胞含有较高浓度的L-Glu和Gly。为了证实这种 推测，将E. coliII-1反复用于GSH合成反应，每次反应中均测定GSH的净增加量以及L-Glu和 Gly的净减少量。结果发现(表3-2-4)，E. coliII-1细胞重复使用5次后，底物氨基酸的消耗量与 产物的合成量才基本达到平衡。此外，在第一次的GSH合成反应进行5 min时，测定出反应 液中的L-Glu和Gly的量分别为84.3 mmol/L和31.8 mmol/L，比L-Glu和Gly的实际添加量分别 高出了24.3 mmol/L和11.8 mmol/L。这些数据充分说明，E. coliII-1细胞内确实含有较高浓度 的L-Glu和Gly，也可能含有少量的L-Cys
表3-2-4细胞回用过程中LGu和Gy的消耗情况 细胞回用次数次GSH增加量/ mmol-L-1 L-Glu消耗量/ mmol.- Gly消耗量/ mmol. L 1356 10.8 12.6 18.5 每次反应时,Glu、Gl和Cys浓度分别为60mmol、20mmoM和20mmo 3、能量辅因子在GSH合成反应中的作用 Meister认为,在GSH的生物合成反应中,GSH-1和GSH催化的反应都需要ATP的参与 因此,每合成1 mol gsh,需要消耗2 mol AtP,生成2 mol ADP,如式(3-2-1)所示 LGu+LCys+AIP_SH,yL-谷氨酰L半胱氨酸+ADP+P1 GSH-ⅡI (3-2-1) γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸+Gily+ATP GSH+ADP + P 然而,图3-2-7的结果却显示,当AIP浓度低于20mmoL时,GSH对AIP的摩尔产率系 数在85~90%之间,即GSH合成与ATP消耗的比例接近1:1。为了更深入地对这一实验现象 进行分析,在ATP初始浓度为20mmo/L的条件下,测定了GSH合成过程中ATP、ADP和AMP 的变化,结果示于图3-2-8。 0102030405060 0.511.522.53 c(ATP)/(mmol/L) /h 图3-27AP浓度对GSH合成的影响图3-2-8GSH合成反应过程中能量辅因子的变化 注:反应时间为2h。●GSH;口ATP,△ADP,OAMP 根据图32-8的结果,可以认为,由E.colhⅢ-1细胞控制的GSH合成反应机理应当如 (3-2-2)式所示,其中GSH-Ⅱ控制的第二步反应为整个反应的限速步骤。 GSH-I L-Glu +L-Cys+ ATP y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸+ADP+Pi GSH-II (3-2-2) Y-L-谷氨酰L半胱氨酸+Gly+AD GSH+AMP+ Pi 提出这一反应机理是基于以下五点实验现象 GSH合成反应中AIP降解的终产物为AMP,AMP和GSH的生成量之比接近1:1: ②反应中ATP消耗与GSH生成之比接近1:1: ③由于质粒pGH501中gshI与gsh的拷贝数之比为2:1,因此GSH-I的活性更高。在反应 的第一阶段(0~0.5h),AIP消耗了155mmo,而GSH仅生成68mmo/L,表明GSH-I催化 生成的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸,由于GSH-Ⅱ活性的限制,来不及转化为GSH
15 表3-2-4 细胞回用过程中L-Glu和Gly的消耗情况 细胞回用次数/次 GSH增加量/ mmolL -1 L-Glu消耗量/ mmolL -1 Gly消耗量/ mmolL -1 1 16.9 9.2 8.7 3 16.8 10.8 12.6 5 16.7 18.1 15.8 6 16.7 18.5 17.5 注∶每次反应时，Glu、Gly和Cys浓度分别为60 mmol/L、20 mmol/L和20 mmol/L 3、能量辅因子在GSH合成反应中的作用 Meister认为，在GSH的生物合成反应中，GSH-I和GSH-II催化的反应都需要ATP的参与。 因此，每合成1 mol GSH，需要消耗2 mol ATP，生成2 mol ADP，如式(3-2-1)所示。 L-Glu + L-Cys + ATP -L-谷氨酰-L-半胱氨酸 + ADP + Pi -L-谷氨酰-L-半胱氨酸 + Gly + ATP GSH + ADP + Pi GSH-I GSH-II (3-2-1) 然而，图3-2-7的结果却显示，当ATP浓度低于20 mmol/L时，GSH对ATP的摩尔产率系 数在85～90%之间，即GSH合成与ATP消耗的比例接近1∶1。为了更深入地对这一实验现象 进行分析，在ATP初始浓度为20mmol/L的条件下，测定了GSH合成过程中ATP、ADP和AMP 的变化，结果示于图3-2-8。 0 4 8 12 16 20 0 10 20 30 40 50 60 c (ATP) / (mmol/L) c (GSH) / (mmol/L) 0 4 8 12 16 20 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 t / h c (ATP,ADP,AMP)/(mmol/L) 0 4 8 12 16 20 c (GSH) / (mmol/L) 图3-2-7 ATP浓度对GSH合成的影响 图3-2-8 GSH合成反应过程中能量辅因子的变化 注∶反应时间为2h。● GSH; □ ATP; △ ADP; ○ AMP 根据图3-2-8的结果，可以认为，由E. coli Ⅱ-1细胞控制的GSH合成反应机理应当如 (3-2-2)式所示，其中GSH-Ⅱ控制的第二步反应为整个反应的限速步骤。 L-Glu + L-Cys + ATP -L-谷氨酰-L-半胱氨酸 + ADP + Pi -L-谷氨酰-L-半胱氨酸 + Gly + ADP GSH + AMP + Pi GSH-I GSH-II (3-2-2) 提出这一反应机理是基于以下五点实验现象∶ ①GSH合成反应中ATP降解的终产物为AMP，AMP和GSH的生成量之比接近1∶1； ②反应中ATP消耗与GSH生成之比接近1∶1； ③由于质粒pGH501中gshⅠ与gshⅡ的拷贝数之比为2∶1，因此GSH-Ⅰ的活性更高。在反应 的第一阶段(0～0.5h)，ATP消耗了15.5 mmol/L，而GSH仅生成6.8 mmol/L，表明GSH-Ⅰ催化 生成的-L-谷氨酰-L-半胱氨酸，由于GSH-Ⅱ活性的限制，来不及转化为GSH；