第二节ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用 、ATP再生系统 20世纪60年代以来固定化技术的飞速发展,极大地促进了作为高效催化剂的酶和微生 物细胞在实际工业生产中的应用。目前,固定化细胞和酶不仅已被用于大规模连续生产医药 生物和营养方面的重要产品,而且在有机合成、化学和临床分析、食品工业、医药以及生物 化学的基础研究领域中也倍受人们关注。然而,遗憾的是,直到现在,固定化酶的工业应用 几乎全限于催化降解反应或简单的转化反应,在复杂合成过程中的应用鲜有报道,对人们所 关心的由简单前体合成复杂分子的过程更是研究甚少。而实际上,许多有用的、特别是那些 本来由传统发酵工艺生产的化合物,在细胞中通常是通过多酶反应合成的,因此,如何建立 一个合理的生物反应系统以实现有用化合物的高效生产,近年来已成为生化工程研究者所注 目的焦点问题。 阻碍多步酶反应经济可行工艺发展的屏障在于缺乏辅因子如5-三磷酸腺苷(AIP)和烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及辅酶A的再生和保留系统,故构建辅因子再生系统,无论是对 酶的经济利用还是对提高反应效率来讲都是必需的。其中又以AIP再生系统最为重要,因 为ATP通常作为生物合成酶反应生产有用物质所必需的能量来源,但ATP的价格又相对昂 贵,经济上不允许在反应过程中直接添加ATP。因此,一旦需要利用生物合成酶反应生产某 些物质,ATP提供方式是否经济、有效,直接影响反应的成功与否 ATP再生系统可定义为一个需要ATP的生物酶反应系统与一个ATP生物合成系统所构 成的耦合系统。一般地,ATP在降解为ADP(或AMP)的同时,释放贮存在AP分子中的能 量用于生物合成反应。若能建立一个适宜的反应系统,在这个系统中,由ATP降解而来的 ADP(或AMP)可通过其它途径再合成ATP,使AP能够循环使用,这样就有可能采用能够 再生ATP的廉价底物来替代ATP,从而提高有用物质生产过程的经济性 到目前为止所报道的ATP再生系统中,如果按底物的不同来分类,可以分为转移高能 磷酸基的反应系统和采用碳水化合物作为基质的反应系统。前一系统由于采用高能化合物作 为底物,实验室规模操作的效率虽然较高,但在工业上使用却很不稳定,会导致AIP再生 反应总产率的下降,且大规模提供这些物质也有问题,故用途不广。后一系统与前者相比优 势明显。因为从工业规模AP再生反应的角度来看,碳水化合物和磷酸基团无疑是价廉 稳定且能够大规模提供的基质。采用碳水化合物为基质再生ATP,通常需要多种参与糖代谢 的酶,由于不太可能分离出酵解系统的所有酶,故可以采用含有这些酶的微生物细胞作为合 成ATP的酶源。根据酶源的不同,又可将利用碳水化合物为基质的ATP再生系统再分为自 耦合系统(图3-2-1)和种间耦合系统(图3-2-2)
6 第二节 ATP 再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用 一、ATP 再生系统 20 世纪 60 年代以来固定化技术的飞速发展，极大地促进了作为高效催化剂的酶和微生 物细胞在实际工业生产中的应用。目前，固定化细胞和酶不仅已被用于大规模连续生产医药、 生物和营养方面的重要产品，而且在有机合成、化学和临床分析、食品工业、医药以及生物 化学的基础研究领域中也倍受人们关注。然而，遗憾的是，直到现在，固定化酶的工业应用 几乎全限于催化降解反应或简单的转化反应，在复杂合成过程中的应用鲜有报道，对人们所 关心的由简单前体合成复杂分子的过程更是研究甚少。而实际上，许多有用的、特别是那些 本来由传统发酵工艺生产的化合物，在细胞中通常是通过多酶反应合成的，因此，如何建立 一个合理的生物反应系统以实现有用化合物的高效生产，近年来已成为生化工程研究者所注 目的焦点问题。 阻碍多步酶反应经济可行工艺发展的屏障在于缺乏辅因子如 5'-三磷酸腺苷(ATP)和烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及辅酶 A 的再生和保留系统，故构建辅因子再生系统，无论是对 酶的经济利用还是对提高反应效率来讲都是必需的。其中又以 ATP 再生系统最为重要，因 为 ATP 通常作为生物合成酶反应生产有用物质所必需的能量来源，但 ATP 的价格又相对昂 贵，经济上不允许在反应过程中直接添加 ATP。因此，一旦需要利用生物合成酶反应生产某 些物质，ATP 提供方式是否经济、有效，直接影响反应的成功与否。 ATP 再生系统可定义为一个需要 ATP 的生物酶反应系统与一个 ATP 生物合成系统所构 成的耦合系统。一般地，ATP 在降解为 ADP(或 AMP)的同时，释放贮存在 ATP 分子中的能 量用于生物合成反应。若能建立一个适宜的反应系统，在这个系统中，由 ATP 降解而来的 ADP(或 AMP)可通过其它途径再合成 ATP，使 ATP 能够循环使用，这样就有可能采用能够 再生 ATP 的廉价底物来替代 ATP，从而提高有用物质生产过程的经济性。 到目前为止所报道的 ATP 再生系统中，如果按底物的不同来分类，可以分为转移高能 磷酸基的反应系统和采用碳水化合物作为基质的反应系统。前一系统由于采用高能化合物作 为底物，实验室规模操作的效率虽然较高，但在工业上使用却很不稳定，会导致 ATP 再生 反应总产率的下降，且大规模提供这些物质也有问题，故用途不广。后一系统与前者相比优 势明显。因为从工业规模 ATP 再生反应的角度来看，碳水化合物和磷酸基团无疑是价廉、 稳定且能够大规模提供的基质。采用碳水化合物为基质再生 ATP，通常需要多种参与糖代谢 的酶，由于不太可能分离出酵解系统的所有酶，故可以采用含有这些酶的微生物细胞作为合 成 ATP 的酶源。根据酶源的不同，又可将利用碳水化合物为基质的 ATP 再生系统再分为自 耦合系统(图 3-2-1)和种间耦合系统(图 3-2-2)
ADP或AMP 葡萄糖 再生ATP的反应系统 化碳 有机酸 ATP 需要ATP的生物合成反应 产物 ADP或AMP 微生物细胞 图3-2-1自耦合ATP再生系统示意图 大肠杆菌 前体 需要ATP的生物酶反应 产物 ATP ADP(AMP) 葡萄糖一-再生ATP的反应系统 氧化碳 有机酸(或乙醇) 产氨短杆菌或面包酵母 图3-2-2种间耦合ATP再生系统示意图 )ATP再生系统的必要条件 为了建立如图3-2-1和图3-22所示的耦合反应系统并成功地用于实际生产,必须满足 以下条件∶(1)用于合成产物的酶的活性必须足够强且稳定;(2)能大量提供廉价、稳定的前 体物质:(3)再生AP的活性足够强且稳定,能与生物合成酶反应成功地耦合;(4)提供廉价 的能量底物(如葡萄糖)和磷酸基团供体(如无机磷酸盐)以利于AIP再生:(5)若有类似于分解 反应的有害副反应,则必须对其加以控制;(6)若底物或预定的产物不能透过细胞膜,则必 须设法提高膜的通透性。 (二)自耦合ATP再生系统 1、反应系统概述 如图3-2-1所示,在自耦合反应系统中,生物合成酶反应所消耗的ATP被具有ATP合 成活性的同种微生物菌株再生,后再用于生物合成反应。故只需提供葡萄糖和目标产物的前 体,生物合成反应便可以进行下去,而无需添加超过催化剂量的昂贵的AIP。下面就举几个 采用自耦合反应系统生产有用物质的例子。 2、GMP(5-鸟苷酸钠盐)生产过程 KMP+NH3+ATP--GMP+ AMP+PP GMP具有很强的调味功能,全世界每年的需求量为数千吨。产氨短杆菌( Brevibacterium ammol/Loniagenes)具有转化XMP(5-磷酸黄苷)生成GMP的能力,此外还需要添加葡萄糖和
7 再生ATP的反应系统 需要ATP的生物合成反应 ATP ADP或AMP ADP或AMP 葡萄糖 前体 产物 微生物细胞 二氧化碳 水和有机酸 图 3-2-1 自耦合 ATP 再生系统示意图 需要ATP的生物酶反应 再生ATP的反应系统 ATP ADP(AMP) 前体 产物 葡萄糖 二氧化碳、水 有机酸(或乙醇) 大肠杆菌 产氨短杆菌或面包酵母 图 3-2-2 种间耦合 ATP 再生系统示意图 (一)ATP 再生系统的必要条件 为了建立如图 3-2-1 和图 3-2-2 所示的耦合反应系统并成功地用于实际生产，必须满足 以下条件∶(1)用于合成产物的酶的活性必须足够强且稳定；(2)能大量提供廉价、稳定的前 体物质；(3)再生 ATP 的活性足够强且稳定，能与生物合成酶反应成功地耦合；(4)提供廉价 的能量底物(如葡萄糖)和磷酸基团供体(如无机磷酸盐)以利于 ATP 再生；(5)若有类似于分解 反应的有害副反应，则必须对其加以控制；(6)若底物或预定的产物不能透过细胞膜，则必 须设法提高膜的通透性。 (二)自耦合 ATP 再生系统 1、反应系统概述 如图 3-2-1 所示，在自耦合反应系统中，生物合成酶反应所消耗的 ATP 被具有 ATP 合 成活性的同种微生物菌株再生，后再用于生物合成反应。故只需提供葡萄糖和目标产物的前 体，生物合成反应便可以进行下去，而无需添加超过催化剂量的昂贵的 ATP。下面就举几个 采用自耦合反应系统生产有用物质的例子。 2、GMP(5'-鸟苷酸钠盐)生产过程 XMP＋NH3＋ATP→GMP＋AMP＋PPi GMP 具有很强的调味功能，全世界每年的需求量为数千吨。产氨短杆菌(Brevibacterium ammol/Loniagenes)具有转化 XMP(5'-磷酸黄苷)生成 GMP 的能力，此外还需要添加葡萄糖和
铵离子。由于产物GMP不能透过细胞膜,因而必须加入一种表面活性剂( POESA,聚氧乙 烯硬脂酰胺)以提高细胞膜的渗透性。该菌的缺点是具有核苷酸分解酶活性,能分解XM 和GMP:并具有磷酸化GMP生成GDP和GTP的酶活性,还能转移ATP的磷酸基团到GMP 的3'位置,这些都会导致GMP的产率下降。选育低核苷酸分解活性的菌株及进一步控制有 关酶的形成可克服前一困难,而后面的问题则可通过优化反应条件来解决。 3、AIP(腺嘌呤核苷-5-三磷酸钠盐)生产过程 葡萄糖→PRPP(磷酸核糖焦磷酸) 腺嘌呤+PRPP→AMP+PPi ATP可用作生化试剂及治疗心脏疾病、肌肉营养障碍的药物。用腺苷和AMP作为前体 可积累大量AP。近来发现,用腺嘌呤作为AP生产的前体可能更为适宜,因为化学合成 的腺嘌呤价格比较低廉。唯一的问题是腺嘌呤分子中不含核糖,若要用腺嘌呤作为前体,必 须以某种方式提供核糖。一种同时具有PRPP(磷酸核糖焦磷酸)生物合成活性与AP生物合 成活性的产氨短杆菌可利用腺嘌呤为前体生产AP。实验中观察到当ATP开始积累时反应 便告停止,分析发现,镁离子是这一转化过程必须的辅因子,但AIP对二价金属离子有很 强的螯合作用,而被ATP螯合后的镁离子不能作为辅因子,镁离子不足抑制了反应的继续 进行。为此必须随着反应的进行适当补加镁离子以防止反应液中镁离子的缺乏。 4、GSH(谷胱甘肽)的生产过程 Gilu+Cys+ATP→y-GC(γ-谷氨酰半胱氨酸 Y-GC+Gly +ATP-GSH+ADP+Pi GSH是生物体内一种重要的生物活性三肽,通常用作治疗肝脏疾病的药物。它是由y 谷氨酸半胱氨酸合成酶(GSHI)和谷胱甘肽合成酶(GSH)在ATP存在下催化L-谷氨酸、L 半胱氨酸和甘氨酸的一个序贯酶反应合成的。每合成1摩尔GSH需消耗2摩尔ATP。用于 核苷酸生产的产氨短杆菌不能用作合成GSH的酶源,因为该菌中GSHI和GSHⅡ的活性非 常弱。有报道说,将编码GSHⅠ和GSHⅡ的基因gsh/和gsh∥自克隆入E.coi中,构建 株具有高GSH合成活性的重组E.coli,利用该菌可建立一个用于生产GSH的自耦合反应系 统,反应液中积累的GSH比出发菌株提高了10倍。研究结果还表明该菌中AIP再生系统 的效率是影响GSH产率的主要因素 (三)种间耦合ATP再生系统 1、反应系统概况 自耦合ATP再生系统由于只用到一种微生物,故该菌中必须同时具有需要ATP的生物 合成反应的酶活性和再生ATP的酶活性。要提高自耦合反应系统的效率,必须同时提高这 两个系统的活性,而实际上这很难做到。一方面,虽然目前采用重组DNA技术可显著促进 特定酶的活性,但酶活性的提高与作为酶活性供体的细胞数量成反比,故所需的细胞量将大 量减少:另一方面,ATP的生物合成是一个多酶反应系统,要想分离出参与反应和促进活性 表达的全部酶的基因非常困难,采用重组DNA技术也很难大幅度提高其活性,由此导致的 结果是,用于反应的细胞数量又不能减少。这样就形成了一个矛盾。 由此想到,如果能采用不同的微生物,一种作为AP合成活性的供体,另一种作为与 此相偶联的生物合成酶活性的供体(图3-2-2),即可构成一个种间耦合ATP再生系统。这 系统的优点在于:①合成酶活性供体可以自如地从多种微生物中选择:;②采用重组DNA技
8 铵离子。由于产物 GMP 不能透过细胞膜，因而必须加入一种表面活性剂(POESA，聚氧乙 烯硬脂酰胺)以提高细胞膜的渗透性。该菌的缺点是具有核苷酸分解酶活性，能分解 XMP 和 GMP；并具有磷酸化 GMP 生成 GDP 和 GTP 的酶活性，还能转移 ATP 的磷酸基团到 GMP 的 3'位置，这些都会导致 GMP 的产率下降。选育低核苷酸分解活性的菌株及进一步控制有 关酶的形成可克服前一困难，而后面的问题则可通过优化反应条件来解决。 3、ATP(腺嘌呤核苷-5'-三磷酸钠盐)生产过程 葡萄糖→PRPP(磷酸核糖焦磷酸) 腺嘌呤＋PRPP→AMP＋PPi ATP 可用作生化试剂及治疗心脏疾病、肌肉营养障碍的药物。用腺苷和 AMP 作为前体 可积累大量 ATP。近来发现，用腺嘌呤作为 ATP 生产的前体可能更为适宜，因为化学合成 的腺嘌呤价格比较低廉。唯一的问题是腺嘌呤分子中不含核糖，若要用腺嘌呤作为前体，必 须以某种方式提供核糖。一种同时具有 PRPP(磷酸核糖焦磷酸)生物合成活性与 ATP 生物合 成活性的产氨短杆菌可利用腺嘌呤为前体生产 ATP。实验中观察到当 ATP 开始积累时反应 便告停止，分析发现，镁离子是这一转化过程必须的辅因子，但 ATP 对二价金属离子有很 强的螯合作用，而被 ATP 螯合后的镁离子不能作为辅因子，镁离子不足抑制了反应的继续 进行。为此必须随着反应的进行适当补加镁离子以防止反应液中镁离子的缺乏。 4、GSH(谷胱甘肽)的生产过程 Glu＋Cys＋ATP→-GC(-谷氨酰半胱氨酸) -GC＋Gly＋ATP→GSH＋ADP＋Pi GSH 是生物体内一种重要的生物活性三肽，通常用作治疗肝脏疾病的药物。它是由- 谷氨酸半胱氨酸合成酶(GSHⅠ)和谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)在 ATP 存在下催化 L-谷氨酸、L- 半胱氨酸和甘氨酸的一个序贯酶反应合成的。每合成 1 摩尔 GSH 需消耗 2 摩尔 ATP。用于 核苷酸生产的产氨短杆菌不能用作合成 GSH 的酶源，因为该菌中 GSHⅠ和 GSHⅡ的活性非 常弱。有报道说，将编码 GSHⅠ和 GSHⅡ的基因 gshⅠ和 gshⅡ自克隆入 E. coli 中，构建一 株具有高 GSH 合成活性的重组 E. coli，利用该菌可建立一个用于生产 GSH 的自耦合反应系 统，反应液中积累的 GSH 比出发菌株提高了 10 倍。研究结果还表明该菌中 ATP 再生系统 的效率是影响 GSH 产率的主要因素。 (三)种间耦合 ATP 再生系统 1、反应系统概况 自耦合 ATP 再生系统由于只用到一种微生物，故该菌中必须同时具有需要 ATP 的生物 合成反应的酶活性和再生 ATP 的酶活性。要提高自耦合反应系统的效率，必须同时提高这 两个系统的活性，而实际上这很难做到。一方面，虽然目前采用重组 DNA 技术可显著促进 特定酶的活性，但酶活性的提高与作为酶活性供体的细胞数量成反比，故所需的细胞量将大 量减少；另一方面，ATP 的生物合成是一个多酶反应系统，要想分离出参与反应和促进活性 表达的全部酶的基因非常困难，采用重组 DNA 技术也很难大幅度提高其活性，由此导致的 结果是，用于反应的细胞数量又不能减少。这样就形成了一个矛盾。 由此想到，如果能采用不同的微生物，一种作为 ATP 合成活性的供体，另一种作为与 此相偶联的生物合成酶活性的供体(图 3-2-2)，即可构成一个种间耦合 ATP 再生系统。这一 系统的优点在于∶①合成酶活性供体可以自如地从多种微生物中选择；②采用重组 DNA 技
术可显著促进特定酶的活性 在种间耦合反应系统中,通常都采用E.coh作为合成酶活性的受体菌,因为E.cob可 满足大多数重组DNA技术的应用要求。以下举例说明采用重组DNA技术构建的大肠杆菌 和具有较强AP生物合成活性的产氨短杆菌或面包酵母组合而成的种间耦合反应系统。 2、GMP生产过程 日本有学者将编码GMP合成酶(或称XMP胺化酶)的基因从E.col中克隆出,再通过 自克隆使其酶活得以提高。将该菌株的培养液与ⅹMP的发酵液(含有产氨短杆菌突变株)混 合,再加入反应所必需的组分,如葡萄糖、无机磷酸盐和能赋予细胞膜通透性的试剂,以转 化XMP为GMP。由于GMP合成酶活性较高,故转化反应用细胞的培养液体积可减少,这 样,反应开始时ⅹMP的浓度相对较高,反应结東后的GMP浓度也较高,从而提高了生产 3、IMP(5-肌苷酸钠盐)的生产过程 Inosine(肌苷)+ATP→IMP+ADP 采用种间耦合系统生产IMP的思路与GMP生产类似。Mon从E.co中克隆出编码鸟 苷一肌苷激酶(负责IMP合成)的基因,并通过自克隆方法提高了其活性。以产氨短杆菌培养 液中生产的肌苷被用作前体,产氨短杆菌为ATP再生活性细胞,加入具有较强肌苷一鸟苷 激酶活性的E.co培养液,IMP可大量积累。这一过程的优点亦与GMP生产过程类似 4、CDP(胞苷二磷酸)胆碱的生产过程 氯化胆碱十AIP→磷酸胆碱+AD CIP十磷酸胆碱→CDP胆碱 CDP胆碱也是一种用途较广的药物。由于以乳清酸为底物生物合成CIP的途径是一个 多酶参与的复杂反应系统,普遍认为要以乳清酸为前体酶法积累CTP是很困难的。日本学 者发现,产氨短杆菌只能转化乳清酸为UTP而非CTP,使用E.col中负责CTP合成的酶可 解决这一问题,使CTP大量积累。但细菌不具有CDP胆碱生物合成系统,为此,他们克隆 了酵母的CDP胆碱生物合成酶系统以及胆碱激酶(该酶能够磷酸化氯化胆碱)的基因,并使 之在E.co中高效表达。具体操作是,先将来自酵母的CD胆碱合成酶基因和胆碱激酶的 基因结合起来制备一个融合基因,再和来自E.coh的CTP合成酶基因一起插入质粒。这样, 携带重组质粒的E.coh细胞内便具有了三种酶的活性。将重组E.cob和产氨短杆菌的培养 液相混合就可进行CDP胆碱的生产。当然,还需加入二甲苯作为细胞膜渗透剂。结果反应 液中CDP胆碱浓度达到11.7g/L,比起用胞苷和CMP作为前体的传统方法,成本显著下降。 5、GSH的生产过程 Saccharomyces cerevisiae(面包酵母)和E.coh的自耦合ATP再生系统均可生产GSH。前 者的ATP再生能力虽然较强,但GSH合成活性不高:而后者利用乙酸激酶反应再生ATP, 所需的底物乙酰磷酸过于昂贵。 Murata利用S. cerevisiae和E.coli,构建了一个生产GSH的 种间耦合系统,其中S. cerevisiae作为提供AIP的酶源。这一系统可以有两种形式,即共固 定化系统(S. cerevisiae和E.col细胞一起固定化在同一聚丙烯酰胺凝胶中)和混合固定化系 统(S. cerevisiae和E.co分别用聚丙烯酰胺凝胶固定化后再混合使用)。为了使ATP能够在 两种固定化微生物细胞间转移并将其保留在反应器中,必须加入腺嘌呤。实验结果表明,混 合固定化系统的GSH产量略低于共固定化系统,可能是在分别固定化的S. cerevisiae和E
9 术可显著促进特定酶的活性。 在种间耦合反应系统中，通常都采用 E. coli 作为合成酶活性的受体菌，因为 E. coli 可 满足大多数重组 DNA 技术的应用要求。以下举例说明采用重组 DNA 技术构建的大肠杆菌 和具有较强 ATP 生物合成活性的产氨短杆菌或面包酵母组合而成的种间耦合反应系统。 2、GMP 生产过程 日本有学者将编码 GMP 合成酶(或称 XMP 胺化酶)的基因从 E. coli 中克隆出，再通过 自克隆使其酶活得以提高。将该菌株的培养液与 XMP 的发酵液(含有产氨短杆菌突变株)混 合，再加入反应所必需的组分，如葡萄糖、无机磷酸盐和能赋予细胞膜通透性的试剂，以转 化 XMP 为 GMP。由于 GMP 合成酶活性较高，故转化反应用细胞的培养液体积可减少，这 样，反应开始时 XMP 的浓度相对较高，反应结束后的 GMP 浓度也较高，从而提高了生产 率。 3、IMP(5'-肌苷酸钠盐)的生产过程 Inosine(肌苷)＋ATP→IMP＋ADP 采用种间耦合系统生产 IMP 的思路与 GMP 生产类似。Mori 从 E. coli 中克隆出编码鸟 苷─肌苷激酶(负责 IMP 合成)的基因，并通过自克隆方法提高了其活性。以产氨短杆菌培养 液中生产的肌苷被用作前体，产氨短杆菌为 ATP 再生活性细胞，加入具有较强肌苷─鸟苷 激酶活性的 E. coli 培养液，IMP 可大量积累。这一过程的优点亦与 GMP 生产过程类似。 4、CDP(胞苷二磷酸)胆碱的生产过程 氯化胆碱＋ATP→磷酸胆碱＋ADP CTP＋磷酸胆碱→CDP 胆碱 CDP 胆碱也是一种用途较广的药物。由于以乳清酸为底物生物合成 CTP 的途径是一个 多酶参与的复杂反应系统，普遍认为要以乳清酸为前体酶法积累 CTP 是很困难的。日本学 者发现，产氨短杆菌只能转化乳清酸为 UTP 而非 CTP，使用 E. coli 中负责 CTP 合成的酶可 解决这一问题，使 CTP 大量积累。但细菌不具有 CDP 胆碱生物合成系统，为此，他们克隆 了酵母的 CDP 胆碱生物合成酶系统以及胆碱激酶(该酶能够磷酸化氯化胆碱)的基因，并使 之在 E. coli 中高效表达。具体操作是，先将来自酵母的 CDP 胆碱合成酶基因和胆碱激酶的 基因结合起来制备一个融合基因，再和来自 E. coli 的 CTP 合成酶基因一起插入质粒。这样， 携带重组质粒的 E. coli 细胞内便具有了三种酶的活性。将重组 E. coli 和产氨短杆菌的培养 液相混合就可进行 CDP 胆碱的生产。当然，还需加入二甲苯作为细胞膜渗透剂。结果反应 液中 CDP 胆碱浓度达到 11.7g/L，比起用胞苷和 CMP 作为前体的传统方法，成本显著下降。 5、GSH 的生产过程 Saccharomyces cerevisiae(面包酵母)和 E. coli 的自耦合 ATP 再生系统均可生产 GSH。前 者的 ATP 再生能力虽然较强，但 GSH 合成活性不高；而后者利用乙酸激酶反应再生 ATP， 所需的底物乙酰磷酸过于昂贵。Murata 利用 S. cerevisiae 和 E. coli，构建了一个生产 GSH 的 种间耦合系统，其中 S. cerevisiae 作为提供 ATP 的酶源。这一系统可以有两种形式，即共固 定化系统(S. cerevisiae 和 E. coli 细胞一起固定化在同一聚丙烯酰胺凝胶中)和混合固定化系 统(S. cerevisiae 和 E. coli 分别用聚丙烯酰胺凝胶固定化后再混合使用)。为了使 ATP 能够在 两种固定化微生物细胞间转移并将其保留在反应器中，必须加入腺嘌呤。实验结果表明，混 合固定化系统的 GSH 产量略低于共固定化系统，可能是在分别固定化的 S. cerevisiae 和 E
coli的颗粒中ADP和ATP的扩散存在屏障。韩国仁荷大学Koo等也在研究生产GSH的混 合固定化系统,其中E.co经过重组DNA技术提高了GSH合成活性,具有高发酵活力的 S. cerevisiae则作为AIP供体。研究结果尚未发表 (四)ATP再生系统存在的问题 用微生物细胞本身作为酶源构建AP再生系统还有几个问题尚未解决。问题之一,除 了合成产物所需的关键酶以外,细胞内还有许多种酶,其中一些具有分解活性,能将反应的 底物和预定的产物转化为副产物。问题之二,微生物细胞具有很强的自我保护功能,作为渗 透屏障的细胞膜可防止胞内物质滲出。但当细胞用作酶源时,这种屏障就会阻碍底物和产物 进出细胞。因此有必要寻求一种在不降低合成酶活性前提下提高细胞膜通透性的方法 1、抑制副反应的方法 对于具有分解、转移底物或产物为副产物的酶,可通过选育缺失该酶活性的突变株,或 优化反应条件使副产物的形成降低到最小的限度。如在GSH生产中应设法降低y-谷氨酰转 肽酶的活性以避免GSH降解为L半胱氨酰甘氨酸 2、提高膜通透性的方法 目前,多采用酵母或细菌以碳水化合物为基质和能源进行AIP再生。一般地,干燥细 胞或用溶剂、表面活性剂处理细胞都可以提高细胞膜的通透性。但从工业观点看,前两种方 法均存在问题,因为干燥细胞需要大型设备,而大量使用溶剂又会受到消防要求的制约。在 这种形势下,使用表面活性剂的方法无论在经济性、安全性上都可能是最具优势的。 Fujio 硏究发现,聚氧乙烯硬脂酰胺( POESA)对提高细胞膜透性较为适宜。 采用ATP再生系统来生产GMP、IMP、AIP、GSH和CDP胆碱的过程已有很多研究报 道。其中除GSH已通过固定化实现连续生产以外,多数是在悬浮培养体系中构建ATP再生 系统。实际上,从工业观点看,固定化微生物细胞进行有用物质的生产,具有以下优势:① 不需要提取和纯化酶的过程:②细胞可以重复使用:③可以实现连续操作:;④反应器占地小 ⑤反应控制容易:⑥要处理的液体体积小:⑦可以获得高纯度产品:⑨工厂污染减轻。因此, 虽然固定化操作较为繁琐,研究由固定化细胞组成的ATP再生系统生产有用物质的过程, 仍是这一领域今后的发展方向 如果一个需要ATP的生物合成系统包括多步反应,确定哪一种酶是合成途径中最关键 的酶就显得至关重要,因为重组DNA技术并不能无限制地提高所有酶的活性。例如,CDP 胆碱的生产过程需要经过三个步骤,简单地将三种基因导入质粒并不能使之获得充分的表 达,这可能是因为CDP胆碱原本不存在于细菌中的缘故。发展多酶反应系统生产有用物质 的重要性是毋庸置疑的,但确定哪一个是酶反应的关键步骤还有待于进一步探究。此外,虽 然基因重组也很难提高ATP生物合成系统的整体活性,但一旦ATP生物合成系统得以强化, 生产率就可大大提高。从另一个角度说,ATP生物合成系统的活性是目前限制ATP再生系 统推广应用的瓶颈问题 二、ATP再生和谷胱甘肽生物合成的耦合系统 谷胱甘肽(GSH由于具有解毒、抗衰老和抗氧化等重要的生理功能,故而在医药和食品 工业中的应用前景十分广阔。虽然日本利用酵母发酵生产的GSH早在1985年就取得了中国 卫生部的原料药进口许可文号,但由于GSH是酵母胞内产物,提取工艺繁琐及提取成本过 高,使得GSH的价格居高不下,从而限制了它的推广应用
10 coli 的颗粒中 ADP 和 ATP 的扩散存在屏障。韩国仁荷大学 Koo 等也在研究生产 GSH 的混 合固定化系统，其中 E. coli 经过重组 DNA 技术提高了 GSH 合成活性，具有高发酵活力的 S. cerevisiae 则作为 ATP 供体。研究结果尚未发表。 (四)ATP 再生系统存在的问题 用微生物细胞本身作为酶源构建 ATP 再生系统还有几个问题尚未解决。问题之一，除 了合成产物所需的关键酶以外，细胞内还有许多种酶，其中一些具有分解活性，能将反应的 底物和预定的产物转化为副产物。问题之二，微生物细胞具有很强的自我保护功能，作为渗 透屏障的细胞膜可防止胞内物质渗出。但当细胞用作酶源时，这种屏障就会阻碍底物和产物 进出细胞。因此有必要寻求一种在不降低合成酶活性前提下提高细胞膜通透性的方法。 1、抑制副反应的方法 对于具有分解、转移底物或产物为副产物的酶，可通过选育缺失该酶活性的突变株，或 优化反应条件使副产物的形成降低到最小的限度。如在 GSH 生产中应设法降低-谷氨酰转 肽酶的活性以避免 GSH 降解为 L-半胱氨酰甘氨酸。 2、提高膜通透性的方法 目前，多采用酵母或细菌以碳水化合物为基质和能源进行 ATP 再生。一般地，干燥细 胞或用溶剂、表面活性剂处理细胞都可以提高细胞膜的通透性。但从工业观点看，前两种方 法均存在问题，因为干燥细胞需要大型设备，而大量使用溶剂又会受到消防要求的制约。在 这种形势下，使用表面活性剂的方法无论在经济性、安全性上都可能是最具优势的。Fujio 研究发现，聚氧乙烯硬脂酰胺(POESA)对提高细胞膜透性较为适宜。 采用 ATP 再生系统来生产 GMP、IMP、ATP、GSH 和 CDP 胆碱的过程已有很多研究报 道。其中除 GSH 已通过固定化实现连续生产以外，多数是在悬浮培养体系中构建 ATP 再生 系统。实际上，从工业观点看，固定化微生物细胞进行有用物质的生产，具有以下优势∶① 不需要提取和纯化酶的过程；②细胞可以重复使用；③可以实现连续操作；④反应器占地小； ⑤反应控制容易；⑥要处理的液体体积小；⑦可以获得高纯度产品；⑨工厂污染减轻。因此， 虽然固定化操作较为繁琐，研究由固定化细胞组成的 ATP 再生系统生产有用物质的过程， 仍是这一领域今后的发展方向。 如果一个需要 ATP 的生物合成系统包括多步反应，确定哪一种酶是合成途径中最关键 的酶就显得至关重要，因为重组 DNA 技术并不能无限制地提高所有酶的活性。例如，CDP 胆碱的生产过程需要经过三个步骤，简单地将三种基因导入质粒并不能使之获得充分的表 达，这可能是因为 CDP 胆碱原本不存在于细菌中的缘故。发展多酶反应系统生产有用物质 的重要性是毋庸置疑的，但确定哪一个是酶反应的关键步骤还有待于进一步探究。此外，虽 然基因重组也很难提高 ATP 生物合成系统的整体活性，但一旦 ATP 生物合成系统得以强化， 生产率就可大大提高。从另一个角度说，ATP 生物合成系统的活性是目前限制 ATP 再生系 统推广应用的瓶颈问题。 二、ATP 再生和谷胱甘肽生物合成的耦合系统 谷胱甘肽(GSH)由于具有解毒、抗衰老和抗氧化等重要的生理功能，故而在医药和食品 工业中的应用前景十分广阔。虽然日本利用酵母发酵生产的 GSH 早在 1985 年就取得了中国 卫生部的原料药进口许可文号，但由于 GSH 是酵母胞内产物，提取工艺繁琐及提取成本过 高，使得 GSH 的价格居高不下，从而限制了它的推广应用