第十四章核酸类药物 第一节核酸类物质的分离提取及其发酵生产 RNA与DNA的提取与制备 ()RNA的提取与制备 工业用RNA的提取 (1)RNA及其工业来源从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源,如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝 体——青霉素,制霉菌素等菌体。 通常在细菌中RNA占5%~25%,在酵母中占27 6~15%,在霉菌中占07%~28%
第十四章 核酸类药物 第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产 一、RNA与DNA的提取与制备 （一）RNA的提取与制备 1、工业用RNA的提取 （1）RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝 体——青霉素，制霉菌素等菌体。 通常在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7 ％～15％，在霉菌中占0.7%～28％
在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响,其中 关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率 高,易于提取RNA。 很显然在许多酵母中,早期细胞中的RNA含量高, 其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。 (2)高RNA含量酵母菌株的筛选可以从自然界筛选 到RNA含量高的酵母菌株,也可用诱变育种的方法 提高酵母菌的RNA含量
在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中 关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率 高，易于提取RNA。 很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高， 其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。 （2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选 到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法 提高酵母菌的RNA含量
稀碱法:是用氢氧化钠溶液(1%),使细胞壁变 性,使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然 后除去菌体,将pH调至RNA的等电点(pH25,使 RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNAM较 低、磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA,90℃保持 3-4h破坏酶)。 浓盐法:是用高浓度盐溶液(6%8%)处理,同 时加热,以改变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内 释放出来 要避免分子降解,可采用苯酚法制备RNA。用苯 酚处理生物材料,使蛋白质变性,然后离心,上层水 溶液内含有全部RNA,可用乙醇沉淀出来
稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然 后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使 RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNA Mr较 低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 ℃保持 3~4h破坏酶)。 浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同 时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内 释放出来。 要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯 酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水 溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来
脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1moML,不溶于 0.14mo,而核糖核蛋白溶于0.14mo/L盐溶液 (4)RNA的提取实例:啤酒酵母是提取RNA的 很好的资源。取100g压榨啤酒酵母(含水份 70%),加入230m含NaOH3g的水,20℃以下缓 慢搅拌30分钟。用6mol/LHCl调至pH7,搅拌15 分钟,离心得清液255n1。冷至10℃以下,6mol /LHCl调pH25,置冷过夜,离心得RNA18g (纯度80%)
脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于 0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。 （4）RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的 很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份 70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20℃以下缓 慢搅拌30分钟。用6mol／L HCl调至pH7，搅拌15 分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol ／L HCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g （纯度80％）
二)DNA的提取与制备 1.工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg,用绞肉机粉碎2次成浆状, 加入等体积水,搅拌均匀,倾入反应锅内,缓慢搅拌, 升温至100℃,保温15分钟,迅速冷却至20~25℃, 离心除去鱼精蛋白等沉淀物,获得35L含热变性DNA 的溶液,经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解 生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA,在热变性 DNA溶液中逐渐加入等体积95%乙醇,离心可获得纤 维状DNA,沉淀用乙醇、丙酮洗涤,减压低温干燥得 DNA粗品,产品含热变性DNA50%~60%
（二）DNA的提取与制备 1．工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状， 加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌， 升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃， 离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA 的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解 生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性 DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤 维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得 DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％