D0L:10.13374.issn1001-053x.2012.05.003 第34卷第5期 北京科技大学学报 Vol.34 No.5 2012年5月 Journal of University of Science and Technology Beijing May 2012 乳酸菌USTB08的高效培养和生产乳酸 吕乐 张可毅赵鹏尹春华刘晓璐许倩倩闫 海⑧ 北京科技大学化学与生物工程学院，北京100083 g通信f作者，Emai:haiyane@usth.cdu.cn 摘要在成功筛选出一株高产乳酸的乳酸菌USTB-08基础上，分别采用批量和补料发酵培养，通过改变碳源、氮源、碳氮 比、温度和H值等研究了乳酸菌USTB-08生长和产乳酸的优化控制条件.采用蔗糖和酵母膏作为唯一碳源和氮源（碳氮质 量比为5：1)、温度35℃、接种量1.0%及初始pH6.50是提高乳酸菌生长的优化参数.进一步在50L全自控发酵罐中，采用质 量分数为10%氢氧化钠和25%蔗糖混合溶液作为控制pH值和碳源补料的流加液，在pH6.00~7.00范围内，恒定控制 pH6.50获得了最大的乳酸菌生物量(0Dmm13.2),而恒定控制pH7.00则获得了最高的乳酸含量(28.0gL).本研究首 次采用控制H值与流加蔗糖同步进行的培养方式，获得了高细胞浓度的乳酸菌和高质量浓度的乳酸. 关键词乳酸菌：培养；生长：乳酸；pH控制 分类号Q815 High-density cultivation of Lactobacillus sp.USTB-08 and production of lactic acid LO Le,ZHANG Ke-yi,ZHAO Peng,YIN Chun-hua,LIU Xiao-u,XU Qian-qian,YAN Hai School of Chemistry and Biological Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China Corresponding author,E-mail:haiyan@ustb.edu.cn ABSTRACT Based on the successful isolation of a bacterial strain of Lactobacillus sp.USTB-08 for producing lactic acid,the opti- mal control conditions including carbon source,nitrogen source,mass ratio between carbon and nitrogen source,temperature and pH values were investigated for the growth of Lactobacillus sp.USTB-08 and the production of lactic acid in batch cultivation and fed-batch fermentation.Sucrose as the sole carbon source,yeast extract as the sole nitrogen source,the mass ratio of carbon to nitrogen source of 5:1,35 C,the inoculum amount of 1.0%and initial pH 6.50 are the optimal parameters for the growth of Lactobacillus sp.USTB-08 in batch cultivation.In fed-batch cultivation by feeding a mixture of 10%sodium hydroxide and 25%sucrose to control the pH value and supply the carbon source in a 50 L automatic fermenter,the maximum biomass of Lactobacillus sp.USTB-08 (OD13.2)and the maximum content of lactic acid (28.0gL)are obtained at pH 6.50 and pH 7.00 in a pH range from 6.00 to 7.00,respective- ly.The strategy of feeding sucrose and controlling the pH value simultaneously was firstly used in the fed-batch cultivation of Lactoba- cillus sp.and both high cell density and high lactic acid content were obtained. KEY WORDS Lactobacillus sp.:cultivation:growth:lactic acid:pH control 作为有效微生物菌群的主要菌种组成之一，乳源、氮源和无机盐外，还要加入维生素、多种氨基酸 酸菌是一类能够利用糖类发酵产生乳酸细菌的总 和肽等。在批量培养过程中，由于乳酸菌能够把糖 称0.乳酸菌是革兰氏阳性菌，耐酸且不形成芽孢， 类发酵产生乳酸，导致培养体系pH值急剧下降，严 具有促进营养成分的分解和吸收、降低胆固醇、抑制重抑制了乳酸菌的生长和产乳酸.Mussatto四和李 病原菌增殖、增强免疫、改善食品风味和延长储存时 丹等发现，培养过程中由于乳酸的积累和pH值 间等多种功能-).乳酸菌培养过程中除了需要碳 的下降，菌体生长受到抑制.虽然在发酵罐乳酸菌 收稿日期：20110309 基金项目：国家自然科学基金资助项目(20777008)：中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(FRF-AS-10001B)
第 34 卷 第 5 期 2012 年 5 月 北京科技大学学报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol． 34 No． 5 May 2012 乳酸菌 USTB--08 的高效培养和生产乳酸 吕 乐 张可毅 赵 鹏 尹春华 刘晓璐 许倩倩 闫 海 北京科技大学化学与生物工程学院，北京 100083 通信作者，E-mail: haiyan@ ustb． edu． cn 摘 要 在成功筛选出一株高产乳酸的乳酸菌 USTB--08 基础上，分别采用批量和补料发酵培养，通过改变碳源、氮源、碳氮 比、温度和 pH 值等研究了乳酸菌 USTB--08 生长和产乳酸的优化控制条件． 采用蔗糖和酵母膏作为唯一碳源和氮源( 碳氮质 量比为 5∶ 1) 、温度35 ℃、接种量 1. 0% 及初始 pH 6. 50 是提高乳酸菌生长的优化参数． 进一步在 50 L 全自控发酵罐中，采用质 量分数为 10% 氢氧化钠和 25% 蔗糖混合溶液作为控制 pH 值和碳源补料的流加液，在 pH 6. 00 ～ 7. 00 范围内，恒定控制 pH 6. 50获得了最大的乳酸菌生物量( OD680 nm 13. 2) ，而恒定控制 pH 7. 00 则获得了最高的乳酸含量( 28. 0 g·L － 1 ) ． 本研究首 次采用控制 pH 值与流加蔗糖同步进行的培养方式，获得了高细胞浓度的乳酸菌和高质量浓度的乳酸． 关键词 乳酸菌; 培养; 生长; 乳酸; pH 控制 分类号 Q815 High-density cultivation of Lactobacillus sp． USTB-08 and production of lactic acid L Le，ZHANG Ke-yi，ZHAO Peng，YIN Chun-hua，LIU Xiao-lu，XU Qian-qian，YAN Hai School of Chemistry and Biological Engineering，University of Science and Technology Beijing，Beijing 100083，China Corresponding author，E-mail: haiyan@ ustb． edu． cn ABSTRACT Based on the successful isolation of a bacterial strain of Lactobacillus sp． USTB-08 for producing lactic acid，the optimal control conditions including carbon source，nitrogen source，mass ratio between carbon and nitrogen source，temperature and pH values were investigated for the growth of Lactobacillus sp． USTB-08 and the production of lactic acid in batch cultivation and fed-batch fermentation． Sucrose as the sole carbon source，yeast extract as the sole nitrogen source，the mass ratio of carbon to nitrogen source of 5∶ 1，35 ℃，the inoculum amount of 1. 0% and initial pH 6. 50 are the optimal parameters for the growth of Lactobacillus sp． USTB-08 in batch cultivation． In fed-batch cultivation by feeding a mixture of 10% sodium hydroxide and 25% sucrose to control the pH value and supply the carbon source in a 50 L automatic fermenter，the maximum biomass of Lactobacillus sp． USTB-08 ( OD680 nm 13. 2) and the maximum content of lactic acid ( 28. 0 g·L － 1 ) are obtained at pH 6. 50 and pH 7. 00 in a pH range from 6. 00 to 7. 00，respectively． The strategy of feeding sucrose and controlling the pH value simultaneously was firstly used in the fed-batch cultivation of Lactobacillus sp． ，and both high cell density and high lactic acid content were obtained． KEY WORDS Lactobacillus sp． ; cultivation; growth; lactic acid; pH control 收稿日期: 2011--03--09 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 20777008) ; 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目( FRF--AS--10--001B) 作为有效微生物菌群的主要菌种组成之一，乳 酸菌是一类能够利用糖类发酵产生乳酸细菌的总 称［1］． 乳酸菌是革兰氏阳性菌，耐酸且不形成芽孢， 具有促进营养成分的分解和吸收、降低胆固醇、抑制 病原菌增殖、增强免疫、改善食品风味和延长储存时 间等多种功能［2--3］． 乳酸菌培养过程中除了需要碳 源、氮源和无机盐外，还要加入维生素、多种氨基酸 和肽等． 在批量培养过程中，由于乳酸菌能够把糖 类发酵产生乳酸，导致培养体系 pH 值急剧下降，严 重抑制了乳酸菌的生长和产乳酸． Mussatto ［4］和李 丹等［5］发现，培养过程中由于乳酸的积累和 pH 值 的下降，菌体生长受到抑制． 虽然在发酵罐乳酸菌 DOI:10.13374/j.issn1001-053x.2012.05.003
第5期 吕乐等：乳酸菌USTB08的高效培养和生产乳酸 ·603 厌氧培养过程中通过流加碱进行pH值的恒定控 养量30L,控制pH值的流加液组成为10%氢氧化 制，可以缓解pH值过低对乳酸菌生长和产乳酸带 钠和25%蔗糖混合溶液，pH值控制在6.0~7.0之 来的不利影响，但初始底物糖类浓度过高也会在一 间的任何一个恒定值.实验开始后每4取样分别 定程度上抑制乳酸菌的生长.Kadam和靳志强 测定ODm和乳酸含量（测定方法参照文献 等团发现，菌体浓度随初糖浓度的增大而增加，但 00]) 过高的底物浓度反而抑制了细胞的快速增殖.因 2结果与讨论 此，是否能保持培养体系pH值的恒定，同时又能维 持一定的糖类浓度是培养乳酸菌厌氧发酵成败的 2.1批量培养不同碳源对乳酸菌生长的效应 关键. 乳酸菌一般可以利用葡萄糖等多种单糖及一些 本文在成功筛选出一株乳酸菌的基础上，重点 简单寡糖作为碳源.图1显示，与葡萄糖、甘油和糖 围绕乳酸菌的批量和流加培养控制条件的优化进行 蜜相比，蔗糖是支持乳酸菌快速生长的最优碳源，培 了研究.首次采用10%氢氧化钠和25%蔗糖作为 养4d后，其0D6s0m可达1.5.虽然糖蜜中含有蔗糖 控制pH值和糖类的流加液，在成功控制pH值恒定 成分，但能够支持乳酸菌生长的碳源不足，培养4d 的同时流加蔗糖以支持乳酸菌的快速生长和乳酸的 后ODom仅为1.0左右.葡萄糖虽然也可以作为支 高产，本研究对高效培养乳酸菌和发酵生产乳酸具 持乳酸菌生长的碳源，但较蔗糖和糖蜜差，而甘油基 有非常重要的研究意义和应用价值 本不能作为支持乳酸菌生长的碳源.与蔗糖相比， 葡萄糖属于单糖最容易被乳酸菌利用，但在其代谢 1材料与方法 过程中产酸速度较快，从而导致培养基pH值的快 1.1菌种 速降低，因此不适于乳酸菌的快速培养：糖蜜中虽然 本实验所用的乳酸菌是从北京市延庆县妫水湖 含有蔗糖和少量还原糖，但由于糖蜜成分复杂，含有 岸边泥土中分离纯化得到，依据《常见细菌系统鉴 部分有害的无机和有机化合物，阻碍乳酸菌的生长， 定手册》网鉴定为乳酸菌，命名为乳酸菌USTB-O8. 影响乳酸的积累，因此也不适于乳酸菌的培养.谷 1.2培养基 长维)和熊晓辉等回研究发现：麦芽糖和乳糖的 根据文献9]配制批量培养基，其中碳源选择 质量比为1：1是乳酸菌生长的最优碳源。熊涛等围 蔗糖、葡萄糖、甘油和糖蜜：氮源选择酵母膏、蛋白 研究发现葡萄糖质量分数为5%时，乳酸菌 胨、尿素和硝酸钾.通过不同碳氮源批量培养的优 NUCO1O1的菌体浓度最高.本文研究发现乳酸菌 化组合实验，确定流加培养的碳源和氮源组成 USTB-08适宜生长的碳源为蔗糖 1.3研究方法 1.6 1.3.1批量培养碳源和氮源的选择与优化 1.4 ◆蔗糖士葡糖 1.2 ■甘油X糖蜜 选择蔗糖、葡萄糖、甘油和糖蜜四种含碳有机物 分别作为碳源，采用酵母膏、蛋白胨、尿素和硝酸钾 1.0 四种含氮化合物分别作为氮源.通过不同条件组合 0.6 的实验，研究确定批量培养乳酸菌的优化碳源、氮源 0.4 和碳氮比.碳源按照总有机碳为4g·L的量分别 0.2 加入，氮源按照总氯0.4g·Lˉ的初始质量浓度分别 3 加入.培养基和所用器皿均经过121℃下20min的 时间d 高温高压灭菌后使用 图1不同碳源对乳酸菌USTB08生长的效应 1.3.2批量培养控制条件优化 Fig.1 Effects of different carbon sources on the growth of Lactobacil- 在100mL三角瓶中进行密闭厌氧培养，研究了 lus sp.USTB-08 不同培养温度和接种量对乳酸菌生长的效应.实验 开始后，每天取样在722S型分光光度计上测定光密 2.2不同氨源对乳酸菌生长的效应 度(OD6om)以示乳酸菌的生长. 乳酸菌营养要求复杂，正常生长除了需要碳源、 1.3.3控制pH值同步流加碳源的培养实验 氮源和无机盐外，还需要氨基酸和维生素等生长因 依据批量培养优化的条件，在50L全自控发酵 子.图2显示，与硝酸钾、尿素和蛋白胨相比，酵母 罐中进行恒定控制pH值同步流加碳源的实验，培 音是支持乳酸菌快速生长的最优氮源，培养4d后
第 5 期 吕 乐等: 乳酸菌 USTB--08 的高效培养和生产乳酸 厌氧培养过程中通过流加碱进行 pH 值的恒定控 制，可以缓解 pH 值过低对乳酸菌生长和产乳酸带 来的不利影响，但初始底物糖类浓度过高也会在一 定程度上抑制乳酸菌的生长． Kadam［6］和靳志强 等［7］发现，菌体浓度随初糖浓度的增大而增加，但 过高的底物浓度反而抑制了细胞的快速增殖． 因 此，是否能保持培养体系 pH 值的恒定，同时又能维 持一定的糖类浓度是培养乳酸菌厌氧发酵成败的 关键． 本文在成功筛选出一株乳酸菌的基础上，重点 围绕乳酸菌的批量和流加培养控制条件的优化进行 了研究． 首次采用 10% 氢氧化钠和 25% 蔗糖作为 控制 pH 值和糖类的流加液，在成功控制 pH 值恒定 的同时流加蔗糖以支持乳酸菌的快速生长和乳酸的 高产，本研究对高效培养乳酸菌和发酵生产乳酸具 有非常重要的研究意义和应用价值． 1 材料与方法 1. 1 菌种 本实验所用的乳酸菌是从北京市延庆县妫水湖 岸边泥土中分离纯化得到，依据《常见细菌系统鉴 定手册》［8］鉴定为乳酸菌，命名为乳酸菌 USTB--08． 1. 2 培养基 根据文献［9］配制批量培养基，其中碳源选择 蔗糖、葡萄糖、甘油和糖蜜; 氮源选择酵母膏、蛋白 胨、尿素和硝酸钾． 通过不同碳氮源批量培养的优 化组合实验，确定流加培养的碳源和氮源组成． 1. 3 研究方法 1. 3. 1 批量培养碳源和氮源的选择与优化 选择蔗糖、葡萄糖、甘油和糖蜜四种含碳有机物 分别作为碳源，采用酵母膏、蛋白胨、尿素和硝酸钾 四种含氮化合物分别作为氮源． 通过不同条件组合 的实验，研究确定批量培养乳酸菌的优化碳源、氮源 和碳氮比． 碳源按照总有机碳为 4 g·L － 1 的量分别 加入，氮源按照总氮 0. 4 g·L － 1 的初始质量浓度分别 加入． 培养基和所用器皿均经过 121 ℃ 下 20 min 的 高温高压灭菌后使用． 1. 3. 2 批量培养控制条件优化 在 100 mL 三角瓶中进行密闭厌氧培养，研究了 不同培养温度和接种量对乳酸菌生长的效应． 实验 开始后，每天取样在 722S 型分光光度计上测定光密 度( OD680 nm ) 以示乳酸菌的生长． 1. 3. 3 控制 pH 值同步流加碳源的培养实验 依据批量培养优化的条件，在 50 L 全自控发酵 罐中进行恒定控制 pH 值同步流加碳源的实验，培 养量 30 L，控制 pH 值的流加液组成为 10% 氢氧化 钠和 25% 蔗糖混合溶液，pH 值控制在 6. 0 ～ 7. 0 之 间的任何一个恒定值． 实验开始后每 4 h 取样分别 测定 OD680 nm 和 乳 酸 含 量 ( 测定方法参照文献 ［10］) ． 2 结果与讨论 2. 1 批量培养不同碳源对乳酸菌生长的效应 乳酸菌一般可以利用葡萄糖等多种单糖及一些 简单寡糖作为碳源． 图 1 显示，与葡萄糖、甘油和糖 蜜相比，蔗糖是支持乳酸菌快速生长的最优碳源，培 养 4 d 后，其 OD680 nm可达 1. 5． 虽然糖蜜中含有蔗糖 成分，但能够支持乳酸菌生长的碳源不足，培养 4 d 后 OD680 nm仅为 1. 0 左右． 葡萄糖虽然也可以作为支 持乳酸菌生长的碳源，但较蔗糖和糖蜜差，而甘油基 本不能作为支持乳酸菌生长的碳源． 与蔗糖相比， 葡萄糖属于单糖最容易被乳酸菌利用，但在其代谢 过程中产酸速度较快，从而导致培养基 pH 值的快 速降低，因此不适于乳酸菌的快速培养; 糖蜜中虽然 含有蔗糖和少量还原糖，但由于糖蜜成分复杂，含有 部分有害的无机和有机化合物，阻碍乳酸菌的生长， 影响乳酸的积累，因此也不适于乳酸菌的培养． 谷 长维［11］和熊晓辉等［12］研究发现: 麦芽糖和乳糖的 质量比为 1∶ 1是乳酸菌生长的最优碳源． 熊涛等［13］ 研究 发 现 葡 萄 糖 质 量 分 数 为 5% 时，乳 酸 菌 NUC0101 的菌体浓度最高． 本文研究发现乳酸菌 USTB--08 适宜生长的碳源为蔗糖． 图 1 不同碳源对乳酸菌 USTB--08 生长的效应 Fig． 1 Effects of different carbon sources on the growth of Lactobacillus sp． USTB-08 2. 2 不同氮源对乳酸菌生长的效应 乳酸菌营养要求复杂，正常生长除了需要碳源、 氮源和无机盐外，还需要氨基酸和维生素等生长因 子． 图 2 显示，与硝酸钾、尿素和蛋白胨相比，酵母 膏是支持乳酸菌快速生长的最优氮源，培养 4 d 后， ·603·
·604· 北京科技大学学报 第34卷 其ODom可达1.7.蛋白胨虽然也可以作为有机氮 需求量相对较大，而当碳氮质量比为1：1，过高的氮 源支持乳酸菌的生长，但培养4d后0D6s0m仅为0.4 源用量则会抑制乳酸菌的快速生长.此结果说明采 左右，硝酸钾和尿素不能作为氮源支持乳酸菌的生 用蔗糖和酵母膏作为乳酸菌生长的碳源和氮源，碳 长.与蛋白胨和无机氮源相比，酵母膏中含有丰富 氮质量比5：1是培养乳酸菌的优化培养控制条件. 的氨基酸类化合物、B族维生素和生长因子，而乳酸 2.4培养温度、接种量和初始pH值对乳酸菌生长 菌本身合成氨基酸和维生素，尤其是B族维生素的 的效应 能力差，因此酵母音是支持乳酸菌USTB-08生长的 温度不仅支配着酶促反应动力学，而且影响着 最优氮源.谷长维和熊晓辉等☒研究发现：牛肉 微生物的生长速度及化合物的溶解度等，是控制微 膏是乳酸菌生长的最优碳源和氮源.熊涛等)研 生物代谢的重要参数.一方面，随着温度升高，细胞 究发现蛋白陈质量分数为1%时，乳酸菌NUC0101 内酶反应速度加快，代谢相应增加；另一方面，随着 的菌体浓度最高. 温度升高，生物活性物质（蛋白质、核酸等）会发生 2.0 变性，细胞功能下降，甚至死亡.因此，每种微生物 ◆硝酸钾士尿素 都有不同的最适生长温度，同种微生物在不同的培 1.6 青解母膏×蛋白陈 养基中生长的最适温度也有差别.乳酸菌的最适生 1.2 长温度一般随着菌种、培养基成分、培养条件和菌体 生长阶段变化而改变，不同的乳酸菌最适生长温度 范围也会有一定的差异.图4显示采用单因素实验 0.4 方法，培养温度在25~40℃范围内，35℃是培养乳 酸菌的最佳温度.Tango等研究发现42℃是乳 时间 酸菌(Lactobacillus helveticus)生长和产乳酸的最适 图2不同氮源对乳酸菌USTB-08生长的效应 温度.Idris等发现乳酸菌（Lactobacillus Fig.2 Effects of different nitrogen sources on the growth of Lactoba- delbrueckii)的最适生长温度为37℃，乳酸菌USTB- cillus sp.USTB-08 08最适生长温度为35℃，温度过高和过低都会影 2.3不同碳氮比对乳酸菌生长的效应 响乳酸菌的生长 采用蔗糖和酵母膏作为乳酸菌生长的碳源和氨 16 源，在固定碳源用量为10.0gL-1下，通过改变氮源 用量研究了碳氮比对乳酸菌生长的影响.图3显 示，碳氮质量比为5：1时，乳酸菌生长速度最快，培 0.8 养4d后ODs0m为1.3.随着碳氮比的增大，乳酸菌 生长延迟期增加，当碳氮质量比增加到20：1时，乳 酸菌在前4d基本不生长，从第5天才开始生长.乳 75 30 35 酸菌培养属于生长耦联型，在培养过程中菌体的生 温度℃ 长和乳酸的生成是同步进行的，因此菌体对氮源的 图4培养温度对乳酸菌USTB-08生长的效应 1.4 Fig.4 Effects of different temperatures on the growth of Lactobacillus 并碳氮比1：1 sp.USTB-08 1.2+碳氮比5：1 1.0 ■碳氮比10：1 女碳氨比20：1 0.8 接种量的高低直接影响乳酸菌的生长繁殖和乳 0.6 酸的积累，通常接种量较低，菌体生长缓慢且不利于 0.4 乳酸的积累，接种量较高则带入较多的生长代谢物 02 从而影响乳酸菌的生长.图5显示，采用单因素实 0 验方法，接种量为1%时，培养5d后的乳酸菌生物 2 3 时间 量最大0Dm达1.3.说明接种量过低延长乳酸菌 图3不同碳氮比对乳酸菌STBO8生长的效应 的生长延迟期，接种量过高则带入较多的乳酸菌代 Fig.3 Effects of different mass ratios of carbon to nitrogen source on 谢产物从而影响乳酸菌的生长.谷长维和熊晓 the growth of Lactobacillus sp.USTB-08 辉等研究发现乳酸菌活菌数以接种量5%时最
北 京 科 技 大 学 学 报 第 34 卷 其 OD680 nm可达 1. 7． 蛋白胨虽然也可以作为有机氮 源支持乳酸菌的生长，但培养4 d 后 OD680 nm仅为0. 4 左右，硝酸钾和尿素不能作为氮源支持乳酸菌的生 长． 与蛋白胨和无机氮源相比，酵母膏中含有丰富 的氨基酸类化合物、B 族维生素和生长因子，而乳酸 菌本身合成氨基酸和维生素，尤其是 B 族维生素的 能力差，因此酵母膏是支持乳酸菌 USTB--08 生长的 最优氮源． 谷长维［11］和熊晓辉等［12］研究发现: 牛肉 膏是乳酸菌生长的最优碳源和氮源． 熊涛等［13］研 究发现蛋白胨质量分数为 1% 时，乳酸菌 NUC0101 的菌体浓度最高． 图 2 不同氮源对乳酸菌 USTB--08 生长的效应 Fig． 2 Effects of different nitrogen sources on the growth of Lactobacillus sp． USTB-08 图 3 不同碳氮比对乳酸菌 USTB--08 生长的效应 Fig． 3 Effects of different mass ratios of carbon to nitrogen source on the growth of Lactobacillus sp． USTB-08 2. 3 不同碳氮比对乳酸菌生长的效应 采用蔗糖和酵母膏作为乳酸菌生长的碳源和氮 源，在固定碳源用量为 10. 0 g·L － 1 下，通过改变氮源 用量研究了碳氮比对乳酸菌生长的影响． 图 3 显 示，碳氮质量比为 5∶ 1时，乳酸菌生长速度最快，培 养 4 d 后 OD680 nm为 1. 3． 随着碳氮比的增大，乳酸菌 生长延迟期增加，当碳氮质量比增加到 20∶ 1时，乳 酸菌在前 4 d 基本不生长，从第 5 天才开始生长． 乳 酸菌培养属于生长耦联型，在培养过程中菌体的生 长和乳酸的生成是同步进行的，因此菌体对氮源的 需求量相对较大，而当碳氮质量比为 1∶ 1，过高的氮 源用量则会抑制乳酸菌的快速生长． 此结果说明采 用蔗糖和酵母膏作为乳酸菌生长的碳源和氮源，碳 氮质量比 5∶ 1是培养乳酸菌的优化培养控制条件． 2. 4 培养温度、接种量和初始 pH 值对乳酸菌生长 的效应 温度不仅支配着酶促反应动力学，而且影响着 微生物的生长速度及化合物的溶解度等，是控制微 生物代谢的重要参数． 一方面，随着温度升高，细胞 内酶反应速度加快，代谢相应增加; 另一方面，随着 温度升高，生物活性物质( 蛋白质、核酸等) 会发生 变性，细胞功能下降，甚至死亡． 因此，每种微生物 都有不同的最适生长温度，同种微生物在不同的培 养基中生长的最适温度也有差别． 乳酸菌的最适生 长温度一般随着菌种、培养基成分、培养条件和菌体 生长阶段变化而改变，不同的乳酸菌最适生长温度 范围也会有一定的差异． 图 4 显示采用单因素实验 方法，培养温度在 25 ～ 40 ℃ 范围内，35 ℃ 是培养乳 酸菌的最佳温度． Tango 等［14］研究发现 42 ℃ 是乳 酸菌( Lactobacillus helveticus) 生长和产乳酸的最适 温 度． Idris 等［15］ 发 现 乳 酸 菌 ( Lactobacillus delbrueckii) 的最适生长温度为 37 ℃，乳酸菌USTB-- 08 最适生长温度为 35 ℃，温度过高和过低都会影 响乳酸菌的生长． 图 4 培养温度对乳酸菌 USTB--08 生长的效应 Fig． 4 Effects of different temperatures on the growth of Lactobacillus sp． USTB-08 接种量的高低直接影响乳酸菌的生长繁殖和乳 酸的积累，通常接种量较低，菌体生长缓慢且不利于 乳酸的积累，接种量较高则带入较多的生长代谢物 从而影响乳酸菌的生长． 图 5 显示，采用单因素实 验方法，接种量为 1% 时，培养 5 d 后的乳酸菌生物 量最大 OD680 nm达 1. 3． 说明接种量过低延长乳酸菌 的生长延迟期，接种量过高则带入较多的乳酸菌代 谢产物从而影响乳酸菌的生长． 谷长维［11］和熊晓 辉等［12］研究发现乳酸菌活菌数以接种量 5% 时最 ·604·
第5期 吕乐等：乳酸菌USTB08的高效培养和生产乳酸 ·605· 高，乳酸菌USTB-08在接种量为1%时培养获得的 2.5恒定控制pH同步流加蔗糖对乳酸菌生长和 菌体浓度最高 产乳酸的效应 14 图7是在50L全自控发酵罐中，以10%的氢氧 12 化钠和25%蔗糖作为流加液，恒定控制pH值为 1.0 6.00、6.50和7.00下乳酸菌生长和产乳酸的效果 0.8 与pH6.00和7.00相比，在pH6.50下乳酸菌的生 04 长非常迅速，20h后0D6om达到了13.2，远超同期 02 pH6.00和7.00下0D6s0m为4.6和7.4的水平，乳 0.1 0.5 1.0 酸菌生物量提高了187.0%和78.4%（图7(a)). 5.0 接种量/% 在pH7.00时，乳酸产量则最高，24h后达28.0g· 图5不同接种量对乳酸菌USTB-O8生长的效应 L-1,明显高于同期pH6.00和6.50下16.5gL-1 Fig.5 Effects of different inoculum amounts on the growth of Lacto- 和7.3gL-的水平（图7(b)).恒定控制pH值为 bacillus sp.USTB-08 6.50,0~20h内，发酵液中蔗糖的残余量在，从 环境的pH值对微生物的生命活动影响也很 13.5gL1下降到1.2g·L-1,蔗糖加入量则从 大.这主要是因为一方面pH值会引起细胞膜电荷 0gL-1上升到24.1gL-1;20h后，菌体进入稳定 变化，以及影响营养物离子化程度，从而影响微生物 期，蔗糖残余量和加入量均保持稳定（图7（©）).在 对营养物质的吸收；另一方面pH值的改变对酶的 pH6.00和7.00时，整个发酵期内乳酸菌生物量持 活性有影响.一般来说，乳酸菌生长的pH值为 续增加，蔗糖的残余量分别从15.1gL1下降到 5.00~7.00,pH值为6.50~7.00时最适宜乳酸菌 2.2gL-1和从16.5gL1下降到7.9gL-1,蔗糖加 的生长.图6表明，采用单因素实验方法，在初始 入量则分别从0g·L1上升到22.0g·L-1和 pH值为6.00、6.50、7.00、7.50和8.00下，初始pH 42.4gL-1(图7(c)).乳酸发酵属于生长耦联型发 值为6.50是支持乳酸菌快速生长的最优初始pH 酵，在发酵过程中边长菌边产酸，把菌体的生长控制 值，培养5d后0Domm可达1.4.Ohkouchi等a研 在合适的范围(OD值)内，有利于维持高产酸速率 究发现适宜乳酸菌（Lactobacillus manihotivorans 时间.乳酸菌USTB-O8在pH6.50时生长速度最 LMG18011)生长的最适初始pH值为5.0~5.5，当 快，生物量最大，但此时发酵液中蔗糖残余量较低， pH值高于6.0或者低于4.5时，乳酸菌转化淀粉生 不利于乳酸的积累，因此在pH6.50时乳酸产量最 成乳酸的能力降低.谷长维和熊涛等)研究发 低。在一定范围内，乳酸菌发酵液中残糖浓度增加 现乳酸菌适宜生长的环境pH值为弱酸性，分别为 可以提高乳酸的产量m,与pH6.50相比，pH6.00 6.50和6.30~5.80.本文研究发现乳酸菌USTB08 和7.00时，乳酸菌生长速度减慢，生物量降低. 生长的最适初始pH值则为6.50，弱酸性，pH值升 pH6.00时发酵液中蔗糖残余量在2.2g·L-1以上， 高或降低都会影响其生长 乳酸产量略有上升：pH7.00时蔗糖加入量为 42.4gL-1,蔗糖残余量为7.9gL-1,此时乳酸含量 16 14 最高为28.0gL-1 1.2 乳酸菌发酵属于生长耦联型发酵，发酵过程中 1.0 产生乳酸，大量的乳酸积累一方面使发酵液的pH 0.8 值降低，当pH值降到4.0以下时，就会对乳酸菌的 06 生长产生严重的抑制作用：另一方面乳酸的积累还 0 会发生产物抑制作用，影响乳酸菌生长.因此，在乳 酸菌发酵过程中，必须通过流加营养物质、调节pH 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 pH 值和排除代谢产物等方法以获得高密度培养.Mu 图6不同初始pH值对乳酸菌USTB-08生长的效应 等研究发现在补料分批发酵过程中通过流加 Fig.6 Effects of different initial pH values on the growth of Lactoba- NaOH恒定控制pH6.0,12h后每隔2h流加 cillus sp.USTB-08 100gL-1的苯丙酮酸120mL和500g·L-1的葡萄糖
第 5 期 吕 乐等: 乳酸菌 USTB--08 的高效培养和生产乳酸 高，乳酸菌 USTB--08 在接种量为 1% 时培养获得的 菌体浓度最高． 图 5 不同接种量对乳酸菌 USTB--08 生长的效应 Fig． 5 Effects of different inoculum amounts on the growth of Lactobacillus sp． USTB-08 环境的 pH 值对微生物的生命活动影响也很 大． 这主要是因为一方面 pH 值会引起细胞膜电荷 变化，以及影响营养物离子化程度，从而影响微生物 对营养物质的吸收; 另一方面 pH 值的改变对酶的 活性 有 影 响． 一 般 来 说，乳 酸 菌 生 长 的 pH 值 为 5. 00 ～ 7. 00，pH 值为 6. 50 ～ 7. 00 时最适宜乳酸菌 的生长． 图 6 表明，采用单因素实验方法，在初始 pH 值为 6. 00、6. 50、7. 00、7. 50 和 8. 00 下，初始 pH 值为 6. 50 是支持乳酸菌快速生长的最优初始 pH 值，培养 5 d 后 OD680 nm可达 1. 4． Ohkouchi 等［16］研 究发 现 适 宜 乳 酸 菌 ( Lactobacillus manihotivorans LMG18011) 生长的最适初始 pH 值为 5. 0 ～ 5. 5，当 pH 值高于 6. 0 或者低于 4. 5 时，乳酸菌转化淀粉生 成乳酸的能力降低． 谷长维［11］和熊涛等［13］研究发 现乳酸菌适宜生长的环境 pH 值为弱酸性，分别为 6. 50 和 6. 30 ～ 5. 80． 本文研究发现乳酸菌USTB--08 生长的最适初始 pH 值则为 6. 50，弱酸性，pH 值升 高或降低都会影响其生长． 图 6 不同初始 pH 值对乳酸菌 USTB--08 生长的效应 Fig． 6 Effects of different initial pH values on the growth of Lactobacillus sp． USTB-08 2. 5 恒定控制 pH 同步流加蔗糖对乳酸菌生长和 产乳酸的效应 图 7 是在 50 L 全自控发酵罐中，以 10% 的氢氧 化钠和 25% 蔗糖作为流加液，恒定控制 pH 值为 6. 00、6. 50 和 7. 00 下乳酸菌生长和产乳酸的效果． 与 pH 6. 00 和 7. 00 相比，在 pH 6. 50 下乳酸菌的生 长非常迅速，20 h 后 OD680 nm达到了 13. 2，远超同期 pH 6. 00 和 7. 00 下 OD680 nm为 4. 6 和 7. 4 的水平，乳 酸菌生物量提高了 187. 0% 和 78. 4% ( 图 7 ( a) ) ． 在 pH 7. 00 时，乳酸产量则最高，24 h 后达 28. 0 g· L － 1 ，明显高于同期 pH 6. 00 和 6. 50 下 16. 5 g·L － 1 和 7. 3 g·L － 1 的水平( 图 7( b) ) ． 恒定控制 pH 值为 6. 50，0 ～ 20 h 内，发酵液中蔗糖的残余量在，从 13. 5 g·L － 1 下 降 到 1. 2 g·L － 1 ，蔗糖加入量则从 0 g·L － 1 上升到 24. 1 g·L － 1 ; 20 h 后，菌体进入稳定 期，蔗糖残余量和加入量均保持稳定( 图 7( c) ) ． 在 pH 6. 00 和 7. 00 时，整个发酵期内乳酸菌生物量持 续增加，蔗糖的残余量分别从 15. 1 g·L － 1 下降到 2. 2 g·L － 1 和从 16. 5 g·L － 1 下降到 7. 9 g·L － 1 ，蔗糖加 入量 则 分 别 从 0 g·L － 1 上 升 到 22. 0 g·L － 1 和 42. 4 g·L － 1 ( 图 7( c) ) ． 乳酸发酵属于生长耦联型发 酵，在发酵过程中边长菌边产酸，把菌体的生长控制 在合适的范围( OD 值) 内，有利于维持高产酸速率 时间． 乳酸菌 USTB--08 在 pH 6. 50 时生长速度最 快，生物量最大，但此时发酵液中蔗糖残余量较低， 不利于乳酸的积累，因此在 pH 6. 50 时乳酸产量最 低． 在一定范围内，乳酸菌发酵液中残糖浓度增加 可以提高乳酸的产量［17］，与 pH 6. 50 相比，pH 6. 00 和 7. 00 时，乳酸菌生长速度减慢，生 物 量 降 低． pH 6. 00时发酵液中蔗糖残余量在 2. 2 g·L － 1 以上， 乳酸 产 量 略 有 上 升; pH 7. 00 时蔗糖加入量为 42. 4 g·L － 1 ，蔗糖残余量为 7. 9 g·L － 1 ，此时乳酸含量 最高为 28. 0 g·L － 1 ． 乳酸菌发酵属于生长耦联型发酵，发酵过程中 产生乳酸，大量的乳酸积累一方面使发酵液的 pH 值降低，当 pH 值降到 4. 0 以下时，就会对乳酸菌的 生长产生严重的抑制作用; 另一方面乳酸的积累还 会发生产物抑制作用，影响乳酸菌生长． 因此，在乳 酸菌发酵过程中，必须通过流加营养物质、调节 pH 值和排除代谢产物等方法以获得高密度培养． Mu 等［18］研究发现在补料分批发酵过程中通过流加 NaOH 恒 定 控 制 pH 6. 0，12 h 后 每 隔 2 h 流 加 100 g·L － 1 的苯丙酮酸 120 mL 和 500 g·L － 1 的葡萄糖 ·605·
·606 北京科技大学学报 第34卷 14 35 (a) 30 h)米pH6.00 米-pH6.00 在pH6.50 A-pH 6.50 8-pH7.00 35 日pH7.00 6 15 品10 2 5 0 0 12 16 20 24 12 16 20 时间h 时向A 18 45 16 (e) ·…pH6.00时蔗糖剩余量 一pH7.00时糖剩余吊 40 -☆-pH6.50时蔗糖加人量 14 女-pH6.50时蔗袜剩余量 35 12 30 ￡10 …0 ·pH6.00 25 8 时蔗糖 加入 4-pH7.00 15 时蔗糖 加人量 4 10 ◆5 0 12 16 20 24 时间h 图7补料流加培养方式中不同pH值对乳酸菌生长和产乳酸的效应.()乳酸菌生长：(b)乳酸产量：(c)蔗糖加入量和残余量 Fig.7 Effects of pH values on the growth of Lactobacillus sp.USTB-08 and the production of lactic acid in fed-batch fermentation based on pH con- trol:(a)growth of Lactobacillus sp.:(b)yield of lactic acid:(e)feeding and residual amounts of sucrose 50mL,使乳酸菌(Lactobacillus sp.SK007)生长和 功恒定控制H值的同时流加蔗糖以支持乳酸菌的 3-苯基乳酸产量得到了明显提高.Dimg等)研究 快速生长和高产乳酸.在pH6.00~7.00范围内， 发现以氨水控制发酵pH6.25,以指数流加的补料 pH6.50条件下培养20h,获得了大量的乳酸菌生 方式流加850gL1葡萄糖和1%酵母膏，乳酸菌 物量(0D60m13.2),而pH7.00时则获得了大量的 (Lactobacillus casei LA-04-1)的细胞干重可达 乳酸(28.0gL1). 4.3gL-1,乳酸产量可达180gL-1.上述两种流加 参考文献 方式均将pH值控制和糖的流加分开进行，而本研 [1]Kang B.Microecology.Dalian:Dalian Press,1994 究首次将控制PH与同步流加碳源相结合，在成功 (康白.微生态学.大连：大连出版社，1994) 控制发酵液H值恒定的同时同步流加蔗糖作为碳 2] Guo S N,Tian S M,Bai H T.Lactic acid bacteria and their fer- 源，达到了使乳酸菌USTB-08既能够快速生长，又 menting food.Cereal Food Ind,2005,12(1):39 (郭松年，田淑梅，白洪涛.乳酸菌及乳酸菌发酵食品.粮食与 能够高产乳酸的目的（图7），无论是在进一步基础 食品工业，2005,12(1)：39) 研究还是在产业化生产方面均具有重要的意义. B] Salminen S,Ouwehand A C,Isolauri E.Clinical applications of 3 结论 probiotic bacteria.Int Dairy J,1998,8(5/6):563 4] Mussatto SI,Fernandes M,Mancilha I M,et al.Effects of medi- (1)从北京市延庆县妫水湖岸边泥土中分离纯 um supplementation and pH control on lactic acid production from brewer's spent grain.Biochem Eng J,2008,40(3):437 化出一株乳酸菌USTB-08,发现蔗糖和酵母音（碳 [5] Li D,Zhao X H.Chemical de-stressing effect on high-density fer- 氮质量比为5：1)是支持其快速生长的优化碳源和 mentation of Lactobacillus acidophilus.Food Ferment Ind,2007, 氮源，培养温度35℃、接种量1.0%和初始pH6.50 33(3):44 (李丹，赵新淮.嗜酸乳杆菌高密度培养时的化学去胁迫.食 是乳酸菌USTB-08的优化培养控制条件. 品与发酵工业，2007,33(3)：44) (2)在50L全自控发酵罐中，首次采用10%氢 [6]Kadam S R,Patil S S,Bastawde K B,et al.Strain improvement 氧化钠和25%蔗糖作为控制pH值的流加液，在成 of Lactobacillus delbrueckii NCIM 2365 for lactic acid production
北 京 科 技 大 学 学 报 第 34 卷 图 7 补料流加培养方式中不同 pH 值对乳酸菌生长和产乳酸的效应． ( a) 乳酸菌生长; ( b) 乳酸产量; ( c) 蔗糖加入量和残余量 Fig． 7 Effects of pH values on the growth of Lactobacillus sp． USTB-08 and the production of lactic acid in fed-batch fermentation based on pH control: ( a) growth of Lactobacillus sp． ; ( b) yield of lactic acid; ( c) feeding and residual amounts of sucrose 50 mL，使乳酸菌( Lactobacillus sp． SK007) 生长和 3--苯基乳酸产量得到了明显提高． Ding 等［19］研究 发现以氨水控制发酵 pH 6. 25，以指数流加的补料 方式流加 850 g·L － 1 葡萄糖和 1% 酵母膏，乳酸菌 ( Lactobacillus casei LA--04--1 ) 的 细 胞 干 重 可 达 4. 3 g·L － 1 ，乳酸产量可达 180 g·L － 1 ． 上述两种流加 方式均将 pH 值控制和糖的流加分开进行，而本研 究首次将控制 pH 与同步流加碳源相结合，在成功 控制发酵液 pH 值恒定的同时同步流加蔗糖作为碳 源，达到了使乳酸菌 USTB--08 既能够快速生长，又 能够高产乳酸的目的( 图 7) ，无论是在进一步基础 研究还是在产业化生产方面均具有重要的意义． 3 结论 ( 1) 从北京市延庆县妫水湖岸边泥土中分离纯 化出一株乳酸菌 USTB--08，发现蔗糖和酵母膏( 碳 氮质量比为 5∶ 1) 是支持其快速生长的优化碳源和 氮源，培养温度 35 ℃、接种量 1. 0% 和初始 pH 6. 50 是乳酸菌 USTB--08 的优化培养控制条件． ( 2) 在 50 L 全自控发酵罐中，首次采用 10% 氢 氧化钠和 25% 蔗糖作为控制 pH 值的流加液，在成 功恒定控制 pH 值的同时流加蔗糖以支持乳酸菌的 快速生长和高产乳酸． 在 pH 6. 00 ～ 7. 00 范围内， pH 6. 50 条件下培养 20 h，获得了大量的乳酸菌生 物量( OD680 nm 13. 2) ，而 pH 7. 00 时则获得了大量的 乳酸( 28. 0 g·L － 1 ) ． 参 考 文 献 ［1］ Kang B． Microecology． Dalian: Dalian Press，1994 ( 康白． 微生态学． 大连: 大连出版社，1994) ［2］ Guo S N，Tian S M，Bai H T． Lactic acid bacteria and their fermenting food． Cereal Food Ind，2005，12( 1) : 39 ( 郭松年，田淑梅，白洪涛． 乳酸菌及乳酸菌发酵食品． 粮食与 食品工业，2005，12( 1) : 39) ［3］ Salminen S，Ouwehand A C，Isolauri E． Clinical applications of probiotic bacteria． Int Dairy J，1998，8( 5 /6) : 563 ［4］ Mussatto S I，Fernandes M，Mancilha I M，et al． Effects of medium supplementation and pH control on lactic acid production from brewer's spent grain． Biochem Eng J，2008，40( 3) : 437 ［5］ Li D，Zhao X H． Chemical de-stressing effect on high-density fermentation of Lactobacillus acidophilus． Food Ferment Ind，2007， 33( 3) : 44 ( 李丹，赵新淮． 嗜酸乳杆菌高密度培养时的化学去胁迫． 食 品与发酵工业，2007，33( 3) : 44) ［6］ Kadam S R，Patil S S，Bastawde K B，et al． Strain improvement of Lactobacillus delbrueckii NCIM 2365 for lactic acid production． ·606·