不经特殊处理的细菌细胞从环境中吸收外来DNA的过程称为自然转化作 用。G+和G细菌都有自然转化作用，但自然界中并不是所有的菌都能进行自然 转化。固氮菌、芽孢杆菌、链球菌、流感嗜血菌和奈色氏球菌等可进行自然转化。 转化作用可以人为地划分为三个阶段： ①感受态的出现；②DNA的结合和进入：③DNA的整合 ①感受态的出现 感受态：细菌能从周围环境中吸收外源DNA的生理状态。 转化的第一步需要细菌处于感受态。处于感受态的细胞，其吸收DNA的能 力，有时可比一般细胞大100倍。感受态是某些细菌生长到某一特定阶段（常 为对数后期)的一种生理特性，这时细菌表面出现许多双链DNA结合位点。 感受态的出现受该菌的遗传性、菌龄、生理状态和培养条件等的影响。肺炎 链球菌的感受态在对数期后期出现，而芽孢杆菌则出现在对数期末及稳定期。 感受态可持续一段时间，如肺炎链球菌的感受态可持续40分钟，而后消失。 感受态可以诱导产生，例如，大肠杆菌在含有CC2的低温条件下可以诱发 感受态的出现。 细菌在形成感受态的过程中可分泌一种小分子的蛋白质，称为感受态因子 (competence factor),把感受态因子加到不处在感受态的同种细菌培养物 中，可以使细菌处于感受态，即诱导感受态的出现。 ②DNA的结合和进入 双链DNA片断与感受态受体菌的细胞表面特定结合位点结合：核酸内切 酶将吸附着的DNA片断的一个单链切断，被切断的链被核酸外切酶逐渐分解为 寡核苷酸释放到培养基中：同时另一条单链与感受态特异蛋白结合，并以这种 形式进入细胞。 肺炎链球菌和枯草芽孢杆菌对DNA的吸附没有专一性，甚至鲑鱼的DNA 也能被吸附：而流感嗜血杆菌的DNA吸附有高度的专一性，只能吸附其它嗜血 杆菌的DNA。 ③DNA的整合
6 不经特殊处理的细菌细胞从环境中吸收外来 DNA 的过程称为自然转化作 用。G+和 G-细菌都有自然转化作用，但自然界中并不是所有的菌都能进行自然 转化。固氮菌、芽孢杆菌、链球菌、流感嗜血菌和奈色氏球菌等可进行自然转化。 转化作用可以人为地划分为三个阶段： ①感受态的出现；②DNA 的结合和进入；③DNA 的整合 ①感受态的出现 感受态：细菌能从周围环境中吸收外源 DNA 的生理状态。 转化的第一步需要细菌处于感受态。处于感受态的细胞，其吸收 DNA 的能 力，有时可比一般细胞大 100 倍。感受态是某些细菌生长到某一特定阶段(常 为对数后期)的一种生理特性，这时细菌表面出现许多双链 DNA 结合位点。 感受态的出现受该菌的遗传性、菌龄、生理状态和培养条件等的影响。肺炎 链球菌的感受态在对数期后期出现，而芽孢杆菌则出现在对数期末及稳定期。 感受态可持续一段时间，如肺炎链球菌的感受态可持续 40 分钟，而后消失。 感受态可以诱导产生，例如，大肠杆菌在含有 CaCl2 的低温条件下可以诱发 感受态的出现。 细菌在形成感受态的过程中可分泌一种小分子的蛋白质，称为感受态因子 （ competence factor ），把感受态因子加到不处在感受态的同种细菌培养物 中，可以使细菌处于感受态，即诱导感受态的出现。 ②DNA 的结合和进入 双链 DNA 片断与感受态受体菌的细胞表面特定结合位点结合；核酸内切 酶将吸附着的 DNA 片断的一个单链切断，被切断的链被核酸外切酶逐渐分解为 寡核苷酸释放到培养基中；同时另一条单链与感受态特异蛋白结合，并以这种 形式进入细胞。 肺炎链球菌和枯草芽孢杆菌对 DNA 的吸附没有专一性，甚至鲑鱼的 DNA 也能被吸附；而流感嗜血杆菌的 DNA 吸附有高度的专一性，只能吸附其它嗜血 杆菌的 DNA。 ③DNA 的整合
单链DNA进入细胞后，在RecA蛋白的帮助下，与受体菌染色体上的同源 区段配对：通过同源重组以置换的方式整合进受体染色体DNA,经复制和细胞 分裂后形成转化子一一即含有外源DNA的受体菌。 具体过程如图 单链DNA进入细胞后，在RecA蛋白的帮助下，与受体菌染色体上的同源 区段配对，形成氢键：接着受体染色体上被交换下来的相应单链片断被切除， 并被外来的单链DNA所交换和取代，通过连接酶的作用形成了杂合DNA区段： 受体菌染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另 类似受体菌。当细胞分裂后，此染色体分离形成了一个转化子。外源DA片断 转化后，必须整合到染色体上才能形成转化子，质粒DA由于可自主复制，因此， 可在染色体外独立存在。 3.人工转化 大多数原核微生物在自然状态下根本不能转化，需通过人工诱导的方法使细 胞处于感受态，或人为地将DNA导入细胞。 ①二价阳离子介导的转化（热激法）： 用高浓度的Ca2+诱导细胞，使其成为能摄取外源DNA的感受态是1970年由 Mandel和Higa首先发现的，30多年来己广泛用于以大肠杆菌为受体的重组质粒 的转化。 有关钙离子诱导的转化机制目前还不十分清楚，可能是C2+增加了的细胞 通透性。 步骤： 收集对数期细胞→用冷CaCl2处理使之成为感受态一加入外源DA →冰浴中反应30分钟→42℃，热激90秒一涂平板→培养→ 挑取转化子 用此方法，每微克质粒DNA可获得105~10？个转化子。 ②电转化（电击法，electroporation) 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使DNA分子能通过这些小孔进入细胞。 优化参数：电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等 转化效率：109一1010转化子/μgDNA
7 单链 DNA 进入细胞后，在 RecA 蛋白的帮助下，与受体菌染色体上的同源 区段配对；通过同源重组以置换的方式整合进受体染色体 DNA，经复制和细胞 分裂后形成转化子——即含有外源 DNA 的受体菌。 具体过程如图： 单链 DNA 进入细胞后，在 RecA 蛋白的帮助下，与受体菌染色体上的同源 区段配对，形成氢键；接着受体染色体上被交换下来的相应单链片断被切除， 并被外来的单链 DNA 所交换和取代，通过连接酶的作用形成了杂合 DNA 区段； 受体菌染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一 类似受体菌。当细胞分裂后，此染色体分离形成了一个转化子。 外源 DNA 片断 转化后，必须整合到染色体上才能形成转化子，质粒 DNA 由于可自主复制，因此， 可在染色体外独立存在。 3． 人工转化 大多数原核微生物在自然状态下根本不能转化，需通过人工诱导的方法使细 胞处于感受态，或人为地将 DNA 导入细胞。 ①二价阳离子介导的转化（热激法）： 用高浓度的 Ca2+诱导细胞，使其成为能摄取外源 DNA 的感受态是 1970 年由 Mandel 和 Higa 首先发现的，30 多年来已广泛用于以大肠杆菌为受体的重组质粒 的转化。 有关钙离子诱导的转化机制目前还不十分清楚，可能是 Ca2+增加了的细胞 通透性。 步骤： 收集对数期细胞 用冷 CaCl2 处理使之成为感受态 加入外源 DNA 冰浴中反应 30 分钟 42℃，热激 90 秒 涂平板 培养 挑取转化子 用此方法，每微克质粒 DNA 可获得 105～107 个转化子。 ②电转化（电击法，electroporation） 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使 DNA 分子能通过这些小孔进入细胞。 优化参数：电场强度、电脉冲长度、DNA 浓度等 转化效率：109～1010 转化子/μg DNA