福建医科大学：《生物化学与分子生物学》课程教学课件（PPT讲稿）实验五 逆转录PCR法分析小鼠肝糖代谢基因转录水平

生物化学与分子生物学实验小鼠肝糖代谢基因转录水平分析

生物化学与分子生物学实验

实验技术路线RNA提取逆转录正常组mouse肝胰岛素组PCR电泳

mouse 肝 正常组 胰岛素组 PCR 逆转录 RNA提取 实验技术路线 电泳

RNA提取实验原理萃取抽提裂解变性漂洗TRIZOL氯仿异丙醇异硫氰酸胍+苯酚裂解细胞，变性蛋白质促使RNA进入水相沉淀RNA：异丙醇与使RNA与蛋白质分离水互溶，而RNA与杂离心后可形成水相层将RNA释放到溶液中。和有机层。质不溶于异丙醇》RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。>水相层（无色）主要为RNA>有机层（粉色）主要为DNA和蛋白质

一、RNA提取——实验原理 裂解细胞，变性蛋白质， 使RNA与蛋白质分离， 将RNA释放到溶液中。 促使RNA进入水相， 离心后可形成水相层 和有机层。 ➢ RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。 ➢ 水相层（无色）主要为RNA ➢ 有机层（粉色）主要为DNA和蛋白质。 氯仿 TRIZOL 异硫氰酸胍 + 苯酚 裂解变性 萃取抽提 漂洗 沉淀RNA：异丙醇与 水互溶，而RNA与杂 质不溶于异丙醇。 异丙醇

RNA提取实验步骤1、新鲜肝组织（2倍芝麻大小）置EP管中，加200ulTrizol充分研磨后，补加800wlTrizol，枪头吹匀。加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒4℃12000g离心15min。3、将上层水相移至洁净EP管中，加入500ul异丙醇倒混匀。4、4℃12000g离心10min弃水相，EP管开盖干燥，沉淀溶于5.50ulDEPC水中

2、加入200l 氯仿，剧烈震荡15秒， 4℃ 12000g离心15min。 3、将上层水相移至洁净EP管中，加入 500l异丙醇颠倒混匀。 4、4℃ 12000g离心10min。 5、弃水相，EP管开盖干燥，沉淀溶于 50l DEPC水中。 一、RNA提取——实验步骤 1、新鲜肝组织（2倍芝麻大小）置EP管中，加200l Trizol充分研磨后，补加800l Trizol，枪头吹匀

RNA的纯度A260/A280纯DNA1.8Protein纯RNAoos2.0Nucloic Acid蛋白质污染<1.8280260300240320wavelength (nm)Tris作为缓冲液检测OD值>2.0·RNA已经水解成单核酸>2.2

RNA的纯度 A260/A280 1.8 • 纯DNA 2.0 • 纯RNA <1.8 • 蛋白质污染 >2.0 • Tris作为缓冲液检测OD值 >2.2 • RNA已经水解成单核酸