附录一下列致病菌分离鉴定需要进行的最低限度试验项目①.巴氏杆菌属需要制备鲜血琼脂平板、鲜血琼脂斜面、血清肉汤、蔗糖、乳糖、甘露醇培养基、靛基质试验、硝酸盐还原试验、醋酸铅琼脂柱或含醋酸铅纸条等，（注：糖发酵培养基用前需加1滴无菌灭活牛血清）；②．沙门氏菌和大肠杆菌的鉴定用普通肉汤、普通琼脂平板、普通琼脂斜面、三糖铁琼脂斜面、麦康凯培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、杨苷发酵试验培养基，靛基质试验，M.R试验，V.P试验用培养基，柠檬酸盐利用和硝酸盐还原试验用培养基等，必要时尚需要进行细菌血清型鉴定；③.产气荚膜梭菌（梭菌等）鉴定需制备葡萄糖鲜血琼脂平板、葡萄糖血清琼脂平板、厌氧肉肝汤、牛乳培养基、卵磷脂酶试验用培养基，硝酸盐还原试验培养基，麦芽糖、乳糖、杨苷、葡萄糖等发酵试验培养基，必要时要做毒素的中和试验，以确定致病菌型(A, B, C, D, E, ) ;
附录一 下列致病菌分离鉴定需要进行的最低限度试验项目 ①．巴氏杆菌属 需要制备鲜血琼脂平板、鲜血琼脂斜面、血清肉汤、蔗糖、乳糖、甘露醇 培养基、靛基质试验、硝酸盐还原试验、醋酸铅琼脂柱或含醋酸铅纸条等，（注： 糖发酵培养基用前需加 1 滴无菌灭活牛血清）； ②．沙门氏菌和大肠杆菌的鉴定 用普通肉汤、普通琼脂平板、普通琼脂斜面、三糖铁琼脂斜面、麦康凯培 养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、杨苷发酵试验培养基，靛基质试验,M. R 试验，V. P 试验用培养基，柠檬酸盐利用和硝酸盐还原试验用培养基等，必要时尚需要进 行细菌血清型鉴定； ③．产气荚膜梭菌（梭菌等） 鉴定需制备葡萄糖鲜血琼脂平板、葡萄糖血清琼脂平板、厌氧肉肝汤、牛乳 培养基、卵磷脂酶试验用培养基，硝酸盐还原试验培养基，麦芽糖、乳搪、杨 苷、葡萄糖等发酵试验培养基，必要时要做毒素的中和试验，以确定致病菌型 (A,B,C,D,E,)；
附录二培养基与培养基的制备（一）牛肉水（牛肉浸出液）成分：瘦牛肉50g常水100ml制法：（1）除去瘦牛肉的脂肪、腱膜、切成小块，用绞肉机绞碎。（2）称其重量，加倍量水，浸泡一夜（夏天防止腐败应置冷处）。（3）煮沸1h，在加热煮沸中间，应多次搅拌。（4）用纱布滤去肉渣挤出肉水，再用滤纸过滤。（5）补足原水量、分装于瓶中，121C高压蒸汽灭菌20min，置冷暗处保存。注：现多用牛肉营制备肉水，其浓度为0.3%-0.5%。用途：制作各种培养基的基础。注：①牛肉加水后冷浸的目的是使营养物质（不溶性蛋白质）充分浸出。②加热一定时间可使蛋白质凝固，加热不足，一部分蛋白质未能凝固，使培养基很难滤清。③当培养基中pit值调好后，需再加热10min，使酸碱度得到稳定，并使沉淀物下沉。（二）营养肉汤（或普通肉汤）成分；牛肉膏0.5g氯化钠0.5g磷酸氢二钾0.1g蛋白陈1g蒸馏水100ml制法：(1)称取牛肉膏、蛋白陈和盐类后，加人100ml水中，加热溶解，调p1-i7.4至7.6,再加热15min，补足水分。(2)凉后用滤纸过滤，分装（肉汤必须完全透明）。(3)置高压灭菌器内，121C高压蒸汽灭菌20min用途：（1）可供一般细菌生长的液体培养基，用其可检查细菌的生长表现。（2）制备固体培养基的基础。注：此培养基可满足一般细菌的营养需要，蛋自陈提供氮素来源，牛肉膏含多种含氮物质（肌酸、嘌呤类腺昔酸、多种氨基酸、肽类）和含碳物质.还有多种矿物元素，氯化钠提供Na、CI.离子维持细菌细胞内外渗透压，磷酸盐缓冲培养基的pH变化，水为细菌细胞内外物质交换的良好溶剂。（三）营养琼脂（或普通琼脂）成分：牛肉膏0.5g氯化钠0.5g磷酸氢二钾0.1g蒸馏水100ml蛋白陈1g琼脂20g制法：(1）取牛肉膏、蛋白陈、盐类加人水中溶解。（2）将琼脂剪碎，后加人肉汤内，加热使之融化。(3）用0.5mol/LNa0H溶液调pH7.4～7.6，煮沸10-15min，补足蒸发水分至原量。（4）用垫有薄层脱脂棉的双层沙布过滤，分装于试管或三角烧瓶内，加塞，包装。(5）121℃高压蒸汽灭菌20min。倒成普通琼脂平板或摆成普通琼脂斜面，备用。用途：(1）可供一般细菌的分离培养、纯培养：观察菌落性状及保存菌种用。(2)为特殊培养基的基础培养基。注：除了琼脂为一种岩藻糖，一般细菌不能分解它，作为培养基的成分，它只起一个支撑作用，对细
附录二 培养基与培养基的制备 （一）牛肉水（牛肉浸出液） 成分： 瘦牛肉 50 g 常水 100 ml 制法： (1) 除去瘦牛肉的脂肪、腱膜、切成小块，用绞肉机绞碎。 (2) 称其重量，加倍量水，浸泡一夜（夏天防止腐败应置冷处）。 (3) 煮沸 1h,在加热煮沸中间，应多次搅拌。 (4) 用纱布滤去肉渣挤出肉水，再用滤纸过滤。 (5) 补足原水量、分装于瓶中，121 C 高压蒸汽灭菌 20min，置冷暗处保存。 注：现多用牛肉膏制备肉水，其浓度为 0. 3％-0. 5％。 用途：制作各种培养基的基础。 注：① 牛肉加水后冷浸的目的是使营养物质（不溶性蛋白质）充分浸出。 ② 加热一定时间可使蛋白质凝固，加热不足，一部分蛋白质未能凝固，使培养基很难滤清。 ③ 当培养基中 pit 值调好后，需再加热 10min,使酸碱度得到稳定，并使沉淀物下沉。 （二）营养肉汤（或普通肉汤） 成分； 牛肉膏 0.5g 氯化钠 0.5g 磷酸氢二钾 0.1g 蛋白胨 lg 蒸馏水 100 ml 制法： (1)称取牛肉膏、蛋白胨和盐类后，加人 100m1 水中，加热溶解，调 p1-i7. 4 至 7. 6,再加热 15min，补 足水分。 (2)凉后用滤纸过滤，分装（肉汤必须完全透明）。 (3)置高压灭菌器内，121 C 高压蒸汽灭菌 20min . 用途： （1）可供一般细菌生长的液体培养基，用其可检查细菌的生长表现。 （2）制备固体培养基的基础。 注：此培养基可满足一般细菌的营养需要，蛋自胨提供氮素来源，牛肉膏含多种含氮物质（肌酸、嘌呤类、 腺昔酸、多种氨基酸、肽类）和含碳物质．还有多种矿物元素，氯化钠提供 Na+、Cl- .离子维持细菌细胞内 外渗透压，磷酸盐缓冲培养基的 pH 变化，水为细菌细胞内外物质交换的良好溶剂。 （三）营养琼脂（或普通琼脂） 成分： 牛肉膏 0.5g 氯化钠 0.5g 磷酸氢二钾 0.1g 蛋白胨 1g 琼脂 20g 蒸馏水 100 ml 制法： ⑴ 取牛肉膏、蛋白胨、盐类加人水中溶解。 ⑵ 将琼脂剪碎，后加人肉汤内，加热使之融化。 ⑶ 用 0. 5mol／LNaOH 溶液调 pH7. 4～7. 6，煮沸 10- 15min，补足蒸发水分至原量。 ⑷ 用垫有薄层脱脂棉的双层沙布过滤，分装于试管或三角烧瓶内，加塞，包装。 ⑸ 121℃高压蒸汽灭菌 20min。倒成普通琼脂平板或摆成普通琼脂斜面，备用。 用途： ⑴ 可供一般细菌的分离培养、纯培养；观察菌落性状及保存菌种用。 ⑵ 为特殊培养基的基础培养基。 注：除了琼脂为一种岩藻糖，一般细菌不能分解它，作为培养基的成分，它只起一个支撑作用，对细
菌培养基中的营养物吸收不受影响，在43C以下，便凝固，因此，它是制备固体培养基不可少的成分。（四）马丁肉汤成分：猪胃消化液50ml1牛肉浸液50ml葡萄糖1g冰醋酸0.1ml醋酸钠0.6gpH7.2-7.4制法：将猪胃消化液和肉浸液混合，加热至80C时，加冰醋酸1ml（，摇匀，煮沸3-5min，约加15%氢氧化钠溶液2ml，调pH值7.2°-7.4，继续煮沸3-5min，加醋酸钠0.6g，再调pH值7.2一7.4，继续煮沸5～10min，用滤纸滤过，滤后补足水至100ml，再加人葡萄糖0.1g，摇匀，分装，121'C高压蒸汽灭菌，备用。用途：(1）可用于分离培养某些生长条件要求较高的细菌，如猪丹毒丝状杆菌。(2）适宜细菌产生毒素，常用于制造毒素或作毒力试验用。（3）可作为某些支原体培养基的基础培养基。注：①猪胃消化液的制备将新鲜猪胃洗净，去脂绞碎，称取35g，加50℃水100ml，充分摇匀，再加人盐酸（CP比重1：19）1ml，充分混合后，置56℃水浴箱中，消化24h（在消化过程中每小时搅拌一次）。24小时后，可见瓶底只留下很少的组织，消化完毕后，80-85℃加热10min，静置并冷却到25-30℃后，虹吸上清液于瓶中，加人1%氯仿充分振荡，然后置2-8℃，用时虹吸出上清液，滤过。②牛肉浸液制法见实验四。绞碎牛肉比例略不同，为牛肉100g，加水150ml。③目前，马丁肉汤中的猪胃消化液及牛肉浸液已被蛋白陈、牛肉浸膏和酵母浸膏代替。（五）血液琼脂或血清琼脂成分：普通琼脂100ml无菌抗凝血液或脱纤血液5ml制法：（1）无菌操作采取健康动物（绵羊或家免）血液，置于盛有玻璃珠的灭菌三角瓶或加有灭菌的5%柠檬酸钠溶液（血液与其比例约为9：1)的三角瓶内，摇动，制成脱纤血或抗凝血或直接从颈静脉或心脏采血，置于灭菌大试管内，使其自然凝固，次日分离血清备用。(2）将灭菌普通琼脂融化待凉至50℃左右，按5%～10%量将血液或血清加人，混匀后倾注于平血或按5%~10%量将血液或血清加人已分装且已灭菌的普通琼脂于试管中摆成斜面，即为鲜血琼脂平板或斜面，或为血清琼脂平板或斜面，备用。(3）将灭菌普通琼脂柱（5ml/管）融化待凉至50℃左右，按5%～10%量将血液或血清加人，混匀后摆成斜面，即为鲜血琼脂斜面，或为血清琼脂斜面，备用。用途（1）常用于标本中病原菌的初次分离，或某些营养条件要求较高病原菌的培养。(2）用以检查细菌的溶血作用。(3）血斜面常用于保存菌种。注：此培养基制作的关键步骤是采取抗凝血液时应确保无菌，加血液或血清时培养基的温度控制在50℃左右，用前无菌检验。（六）巧克力琼脂成分：普通琼脂100ml无菌脱纤血液5ml制法：(1）将普通琼脂融化后加人脱纤血液混合均匀。(2）保持70-80C，10°-20min，使成为巧克力色
菌培养基中的营养物吸收不受影响，在 43 C 以下，便凝固，因此，它是制备固体培养基不可少的成分。 （四）马丁肉汤 成分： 猪胃消化液 50ml 牛肉浸液 50 ml 葡萄糖 1g 冰醋酸 0.1 ml 醋酸钠 0.6 g pH 7.2-7.4 制法： 将猪胃消化液和肉浸液混合，加热至 80 C 时，加冰醋酸 lml(，摇匀，煮沸 3-5min,约加 15％氢氧化 钠溶液 2m1，调 pH 值 7. 2^-7. 4，继续煮沸 3 - 5min，加醋酸钠 0.6g，再调 pH 值 7. 2 一 7. 4，继续煮 沸 5～1 Omin，用滤纸滤过，滤后补足水至 100 ml，再加人葡萄糖 0.lg，摇匀，分装，121'C 高压蒸汽灭 菌，备用。 用途： ⑴ 可用于分离培养某些生长条件要求较高的细菌，如猪丹毒丝状杆菌。 ⑵ 适宜细菌产生毒素，常用于制造毒素或作毒力试验用。 ⑶ 可作为某些支原体培养基的基础培养基。 注： ① 猪胃消化液的制备将新鲜猪胃洗净，去脂绞碎，称取 35g，加 50℃水 100 ml，充分摇匀，再加人盐酸 (CP 比重 1﹕19) lml，充分混合后，置 56℃水浴箱中，消化 24 h(在消化过程中每小时搅拌一次)。24 小 时后，可见瓶底只留下很少的组织，消化完毕后，80-85℃加热 10min，静置并冷却到 25-30℃后，虹吸上 清液于瓶中，加人 1％氯仿充分振荡，然后置 2-8℃，用时虹吸出上清液，滤过。 ② 牛肉浸液制法见实验四。绞碎牛肉比例略不同，为牛肉 100g，加水 150m1。 ③ 目前，马丁肉汤中的猪胃消化液及牛肉浸液已被蛋白胨、牛肉浸膏和酵母浸膏代替。 （五）血液琼脂或血清琼脂 成分： 普通琼脂 100 ml 无菌抗凝血液或脱纤血液 5 ml 制法： ⑴ 无菌操作采取健康动物（绵羊或家兔）血液，置于盛有玻璃珠的灭菌三角瓶或加有灭菌的 5％柠檬酸钠 溶液（血液与其比例约为 9﹕1)的三角瓶内，摇动，制成脱纤血或抗凝血或直接从颈静脉或心脏采血，置 于灭菌大试管内，使其自然凝固，次日分离血清备用。 ⑵ 将灭菌普通琼脂融化待凉至50℃左右，按5% ～10％量将血液或血清加人，混匀后倾注于平皿或按5% ～ 10％量将血液或血清加人已分装且已灭菌的普通琼脂于试管中摆成斜面，即为鲜血琼脂平板或斜面，或为 血清琼脂平板或斜面，备用。 ⑶ 将灭菌普通琼脂柱（5ml/管）融化待凉至 50℃左右，按 5% ～10％量将血液或血清加人，混匀后摆成 斜面，即为鲜血琼脂斜面，或为血清琼脂斜面，备用。 用途 ⑴ 常用于标本中病原菌的初次分离，或某些营养条件要求较高病原菌的培养。 ⑵ 用以检查细菌的溶血作用。 ⑶ 血斜面常用于保存菌种。 注：此培养基制作的关键步骤是采取抗凝血液时应确保无菌，加血液或血清时培养基的温度控制在 50℃ 左右，用前无菌检验。 （六）巧克力琼脂 成分： 普通琼脂 100 ml 无菌脱纤血液 5 ml 制法： ⑴ 将普通琼脂融化后加人脱纤血液混合均匀。 ⑵ 保持 70-80'C，10^-20min，使成为巧克力色
(3）待冷至50,C倾注平板，无菌检验后置冰箱备用。用途：（1）可供给某些细菌（如嗜血杆菌）的促生长物质如X因子和V因子，疑为嗜血杆菌属的细菌分离培养常用的培养基。(2）具有中和脑膜炎双球菌等毒素作用。（七）半固体琼脂成分：普通肉汤100ml琼脂0.8g制法：（1）将琼脂加人定量普通肉汤中，加热融化后分装于试管中。(2）高压蒸汽灭菌后将试管直立让琼脂凝固。用途：（1）测定细菌的运动性。如有运动力的细菌，可自穿刺线向四周弥散性生长，无运动力的细菌仅沿着穿刺线生长。(2）保存菌种，对营养要求不高的细菌，穿刺培养后于其表面滴加一薄层灭菌液体石蜡，在普通冰箱中可保存3个月左右。（八）胰化大豆琼脂成分：胰化蛋白陈1.5g琼脂1.5g氯化钠0.5g蒸馏水100ml制法：将上述成分混合加热溶解，调pH至7.3，过滤分装，121℃高压蒸汽灭菌24min。用途：用来分离娇细的细菌用培养基，可以替代营养琼脂。（九）STUART运送培养基成分：20%甘油磷酸钠5ml0.1%美蓝0.2ml硫羟代乙酸0.1ml1%氯化钙1ml蒸馏水100ml琼脂0.2g制法：（1）溶解琼脂于50ml水中，让其冷至55'C。（2）将其余成分，除美蓝外，加人到40ml水中，用1mol/LNa0H调pH至7.2，加热至55℃C。(3）将上述溶液混合，调pH至7.3一7.4，最后加人美蓝。用途为一种缓冲的无营养的半固体培养基。临床标本运送到实验室过程中作为菌体的保护剂。（十）邓亨氏蛋白陈水成分：蛋白陈1g氯化钠0.5g蒸馏水100ml制法：(1）将蛋白陈与氯化钠加人蒸馏水中，加热溶解后调pH为7.6，再煮沸加热30min。(2）待冷后用滤纸过滤，分装，121℃高压蒸汽灭菌15min。用途：（1）检查靛基质（即吲哚）用（靛基质试验用）(2)制备糖发酵培养基的基础液。注：一些细菌，如大肠杆菌可以分解蛋白陈中的色氨酸生成吲哚，后者与对二甲基氨基苯甲醛作用，形
⑶ 待冷至 50,C 倾注平板，无菌检验后置冰箱备用。 用途： ⑴ 可供给某些细菌（如嗜血杆菌）的促生长物质如 X 因子和 V 因子，疑为嗜血杆菌属的细菌分离培养常 用的培养基。 ⑵ 具有中和脑膜炎双球菌等毒素作用。 （七）半固体琼脂 成分： 普通肉汤 100 ml 琼脂 0.8g 制法： ⑴ 将琼脂加人定量普通肉汤中，加热融化后分装于试管中。 ⑵ 高压蒸汽灭菌后将试管直立让琼脂凝固。 用途： ⑴ 测定细菌的运动性。如有运动力的细菌，可自穿刺线向四周弥散性生长，无运动力的细菌仅沿着穿刺 线生长。 ⑵ 保存菌种，对营养要求不高的细菌，穿刺培养后于其表面滴加一薄层灭菌液体石蜡，在普通冰箱中可 保存 3 个月左右。 （八）胰化大豆琼脂 成分： 胰化蛋白胨 1.5g 琼脂 1.5 g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100 ml 制法： 将上述成分混合加热溶解，调 pH 至 7.3，过滤分装，121℃高压蒸汽灭菌 24min。 用途： 用来分离娇细的细菌用培养基，可以替代营养琼脂。 （九）STUART 运送培养基 成分： 20％甘油磷酸钠 5 ml 0.1％美蓝 0.2 ml 硫羟代乙酸 0.1 ml 1％氯化钙 1ml 蒸馏水 100 ml 琼脂 0.2g 制法： ⑴ 溶解琼脂于 50ml 水中，让其冷至 55'C。 ⑵ 将其余成分，除美蓝外，加人到 40ml 水中，用 1 mol /L NaOH 调 pH 至 7. 2，加热至 55℃。 ⑶ 将上述溶液混合，调 pH 至 7. 3 一 7.4，最后加人美蓝。 用途 为一种缓冲的无营养的半固体培养基。临床标本运送到实验室过程中作为菌体的保护剂。 （十）邓亨氏蛋白胨水 成分： 蛋白胨 1g 氯化钠 0. 5 g 蒸馏水 100 ml 制法： ⑴ 将蛋白胨与氯化钠加人蒸馏水中，加热溶解后调 pH 为 7. 6，再煮沸加热 30min。 ⑵ 待冷后用滤纸过滤，分装，121℃高压蒸汽灭菌 15min。 用途： ⑴ 检查靛基质（即吲哚）用（靛基质试验用） ⑵ 制备糖发酵培养基的基础液。 注：一些细菌，如大肠杆菌可以分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，后者与对二甲基氨基苯甲醛作用，形