或者用氰乙烯(CH2=CH-CN)使SH氰乙基化(一SHCH2CH2CN)。 蛋白质多肽链被拆开后,要将它们分离纯化。常用的分离纯化方法通常有凝胶 过滤法、离子交换层析法、电泳法等。分离纯化后的每条肽链再进行末端分析。 (二)、末端分析 分析肽链末端氨基酸的方法很多,常用的有以下几种。 1.N—末端氨基酸分析 ①二硝基氟苯法(DNP或FDNB或DNFB)此方法是1945年由 Sanger提 出的,其反应过程如下 NOy RI R2 ON F+H2N一CH-CONH-CH—CO一肽 二硝基氟苯 肽链 ON HN一CH—CONH-CH-CO一肽+HF 硝基苯肽(DNP-肽) 6MHCI R ON/HN--CH-COOH +H2N--CH-COOH DNP氨基酸 氨基酸混合物 DNP—氨基酸可用有机溶剂抽提后,通过层析法来鉴定它是何种氨基酸。 Sanger用此法成功地测定出胰岛素的N末端氨基酸分别为甘氨酸和苯丙氨酸。 ②二甲基氨基萘磺酰氯法(NDS_C),此方法是1956年由哈特利( Hartley) 等人提出的。二甲基氨基萘磺酰氯又称丹磺酰氯,简称DNS_Cl。其反应过程如 下 -CH3 CH3N-CH R PH951 +H2N一CH—CO一肽 +HCl SOCI SO2一 HN--CH-CO一肽 丹磺酰氯 丹磺酰肽
10 或者用氰乙烯（CH2=CH—CN）使—SH 氰乙基化（—SHCH2CH2CN）。 蛋白质多肽链被拆开后，要将它们分离纯化。常用的分离纯化方法通常有凝胶 过滤法、离子交换层析法、电泳法等。分离纯化后的每条肽链再进行末端分析。 (二)、末端分析 分析肽链末端氨基酸的方法很多，常用的有以下几种。 1．N—末端氨基酸分析 ①二硝基氟苯法（DNP 或 FDNB 或 DNFB） 此方法是 1945 年由 Sanger 提 出的，其反应过程如下： NO2 R1 R2 O2N F + H2N—CH—CO—NH—CH—CO—肽 二硝基氟苯 肽链 NO2 R1 R2 O2N HN—CH—CO—NH—CH—CO—肽 + HF 二硝基苯肽（DNP—肽） 6MHCl NO2 R1 R O2N HN—CH—COOH + H2N—CH—COOH DNP—氨基酸 氨基酸混合物 DNP—氨基酸可用有机溶剂抽提后，通过层析法来鉴定它是何种氨基酸。 Sanger 用此法成功地测定出胰岛素的 N—末端氨基酸分别为甘氨酸和苯丙氨酸。 ②二甲基氨基萘磺酰氯法（NDS—Cl） 此方法是 1956 年由哈特利（Hartley） 等人提出的。二甲基氨基萘磺酰氯又称丹磺酰氯，简称 DNS—Cl。其反应过程如 下： CH3—N—CH3 CH3—N—CH3 R1 PH9.5—10.5 + H2N—CH—CO—肽 + HCl R1 SO2Cl SO2—HN—CH—CO—肽 丹磺酰氯 丹磺酰—肽
- CH3 +氨基酸混合物 SO2-HN— CH--COOH 丹磺酰一氨基酸 丹磺酰一氨基酸具有强烈的黄色荧光,可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析法进行鉴 定。此法的优点是灵敏度高(比DNP法高100倍),且丹磺酰一氨基酸的稳定性好 2.C末端氨基酸分析 ①肼解法这是分析C—一末端氨基酸的最常用方法。将多肽溶于无水肼中, 100℃下进行反应,可使C—末端氨基酸以游离状态释放出来,而其它氨基酸都与 肼反应生成氨基酰肼化合物,此类化合物可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯基衍 生物而沉淀。游离的C一末端氨基酸可采用DNS-Cl或DNP等方法进行鉴定 ②羧肽酶水解法羧肽酶可以专一地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一 性不同,可分为羧肽酶A、B、C和Y(A和B来自胰脏,C来自柑桔叶,Y来自面包 酵母)。应用羧肽酶水解C—末端氨基酸时,首先要进行动力学实验,以便选择合 适的酶浓度和反应时间,以保证释放出的氨基酸主要是C一末端氨基酸 (三)、氨基酸组成分析 在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前,首先要了解它是由哪些氨基酸组成 的,每种氨基酸有多少。分析组成的方法有层析法和离子交换层析法两种。层析法 是将多肽链用酸完全水解成游离氨基酸,然后进行DNs( Danny1)标记,聚酰胺薄 膜层析。这是一种超微量的分析方法,但用于定量分析尚不够准确。离子交换层析 是一种精确的氨基酸组分分析的定量方法,它是将多肽链完全水解后,通过离子 交换法使各种氨基酸相互分开,再分别进行定量测定。氨基酸自动分析仪就是在此 基础上发展起来的。 (四)、多肽链的降解 多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂的,因此直接分析多肽链的氨基酸顺序还 是很困难的,多采用将多肽链进一步降解成肽链片段,先分析各片段的氨基酸顺序 再重迭重组确定肽链的全部氨基酸排列顺序。肽链的裂解是蛋白质一级结构研究中 的重要问题,它要求裂解点少,选择性强,反应产率高。目前主要有化学法和酶解 法两种方法。多肽链的降解至少要用两种对肽链有不同裂解点的方法,降解生成两 套以上不同的肽段。否则,将给下一步的重迭重组造成极大的困难 1.化学法 最常用的化学法是溴化氢法,此法能选择性地断裂甲硫氨酸的羧基端肽键。溴
11 CH3—N—CH3 6MHCl + 氨基酸混合物 R1 SO2—HN—CH—COOH 丹磺酰—氨基酸 丹磺酰—氨基酸具有强烈的黄色荧光，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析法进行鉴 定。此法的优点是灵敏度高（比 DNP 法高 100 倍），且丹磺酰—氨基酸的稳定性好。 2．C—末端氨基酸分析 ①肼解法 这是分析 C—末端氨基酸的最常用方法。将多肽溶于无水肼中， 100℃下进行反应，可使 C—末端氨基酸以游离状态释放出来，而其它氨基酸都与 肼反应生成氨基酰肼化合物，此类化合物可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯基衍 生物而沉淀。游离的 C—末端氨基酸可采用 DNS—Cl 或 DNP 等方法进行鉴定。 ②羧肽酶水解法 羧肽酶可以专一地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一 性不同，可分为羧肽酶 A、B、C 和 Y（A 和 B 来自胰脏，C 来自柑桔叶，Y 来自面包 酵母）。应用羧肽酶水解 C—末端氨基酸时，首先要进行动力学实验，以便选择合 适的酶浓度和反应时间，以保证释放出的氨基酸主要是 C—末端氨基酸。 (三)、氨基酸组成分析 在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前，首先要了解它是由哪些氨基酸组成 的，每种氨基酸有多少。分析组成的方法有层析法和离子交换层析法两种。层析法 是将多肽链用酸完全水解成游离氨基酸，然后进行 DNS（Dansyl）标记，聚酰胺薄 膜层析。这是一种超微量的分析方法，但用于定量分析尚不够准确。离子交换层析 是一种精确的氨基酸组分分析的定量方法 ，它是将多肽链完全水解后，通过离子 交换法使各种氨基酸相互分开，再分别进行定量测定。氨基酸自动分析仪就是在此 基础上发展起来的。 (四)、多肽链的降解 多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂的，因此直接分析多肽链的氨基酸顺序还 是很困难的，多采用将多肽链进一步降解成肽链片段，先分析各片段的氨基酸顺序， 再重迭重组确定肽链的全部氨基酸排列顺序。肽链的裂解是蛋白质一级结构研究中 的重要问题，它要求裂解点少，选择性强，反应产率高。目前主要有化学法和酶解 法两种方法。多肽链的降解至少要用两种对肽链有不同裂解点的方法，降解生成两 套以上不同的肽段。否则，将给下一步的重迭重组造成极大的困难。 1．化学法 最常用的化学法是溴化氢法，此法能选择性地断裂甲硫氨酸的羧基端肽键。溴
化氢化学降解法的优点是:①一般蛋白质中含甲硫氨酸较少,因此裂解点少,可获 得较大的肽链片段;②产率在80%以上;③作用条件温和,在室温下作用几到十几 个小时即可 近年来有一种羟胺法开始受到人们的重视。羟胺能专一地裂解天冬酰胺和甘氨 酸之间的肽键(Asn-Gly)。在酸性条件下裂解天冬酰胺和脯氨酸之间的肽键 ( Asp-Pro)。现已有人将这种方法用在某些蛋白质一级结构的分析上。 2.酶解法 酶解法比化学法有更多的优越性,使用也更广泛。因其具有较高的专一性,而 且水解产率较高,所以可选择各种不同专一性的酶进行专一地裂解。常用的酶及其 专一性如下: 氨基酸顺序分析常用蛋白酶及其专一性 酶名称 胰蛋白酶 ψys(赖氨酸)Arg(精氨酸)羧基端肽键 痍凝乳蛋白酶T(色氨酸)y(酪氨酸)Phe(苯丙氨酸)羧基端肽键 弹性蛋白酶 eu(亮氨酸)le(异亮氨酸)Ala(丙氨酸)羧基端肽键 胃蛋白酶 Tyr(酪氨酸、Tp(色氨酸)Phe(苯丙氨酸)氨基端肽键 木瓜蛋白酶 Arg(精氨酸)↓ys(赖氨酸)Gy(甘氨酸)Leu(亮氨酸 等羧基端肽键 Phe(苯丙氨酸)Leu(亮氨酸)』e(异亮氨酸)Tyr(酪氨 嗜热菌蛋白酶酸)、Trp(色氨酸)Met(甲硫氨酸)Val(缬氨酸)的氨基 枯草杆菌蛋白酶疏水侧链氨基酸残基之间的肽键 在酶法裂解肽链时,可适当的选取用一些化学药品来修饰某些氨基酸,以控制 酶的专一性,使所得的肽链片段更大一些。例如,用顺丁烯二酸酐或甲基顺丁烯 酸酐修饰赖氨酸,则胰蛋白酶仅使精氨酸的羧基端肽键断裂,若用1,2或1,3 羰基化合物修饰精氨酸,则胰蛋白酶仅能裂解赖氨酸羧基端肽键。当然,修饰后的 氨基酸还可以解封闭,解封闭后,酶仍能选择性的作用于这些氨基酸的肽键。目前 倾向于采用这种裂解方式 (五)、肽段的分离 肽段的分离方法主要是凝胶过滤法,但单靠凝胶过滤法分离的肽段一般纯度不 够,常需辅以离子交换层析法进行纯化。将裂解后的肽段分离纯化后就逐一地进行 分析 (六)、肽段的顺序分析
12 化氢化学降解法的优点是：①一般蛋白质中含甲硫氨酸较少，因此裂解点少，可获 得较大的肽链片段；②产率在 80%以上；③作用条件温和，在室温下作用几到十几 个小时即可。 近年来有一种羟胺法开始受到人们的重视。羟胺能专一地裂解天冬酰胺和甘氨 酸之间的肽键（Asn—Gly）。在酸性条件下裂解天冬酰胺和脯氨酸之间的肽键 （Asn—Pro）。现已有人将这种方法用在某些蛋白质一级结构的分析上。 2．酶解法 酶解法比化学法有更多的优越性，使用也更广泛。因其具有较高的专一性，而 且水解产率较高，所以可选择各种不同专一性的酶进行专一地裂解。常用的酶及其 专一性如下： 氨基酸顺序分析常用蛋白酶及其专一性 酶 名 称 水 解 的 肽 键 胰蛋白酶 Lys（赖氨酸）、Arg（精氨酸）羧基端肽键 胰凝乳蛋白酶 Trp（色氨酸）、Tyr(酪氨酸）、Phe（苯丙氨酸）羧基端肽键 弹性蛋白酶 Leu（亮氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Ala（丙氨酸）羧基端肽键 胃蛋白酶 Tyr(酪氨酸)、Trp（色氨酸）、Phe（苯丙氨酸）氨基端肽键 木瓜蛋白酶 Arg（精氨酸）、Lys（赖氨酸）、Gly（甘氨酸）、Leu（亮氨酸） 等羧基端肽键 嗜热菌蛋白酶 Phe（苯丙氨酸）、Leu（亮氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Tyr(酪氨 酸)、Trp（色氨酸）、Met（甲硫氨酸）、Val（缬氨酸）的氨基 端肽键 枯草杆菌蛋白酶 疏水侧链氨基酸残基之间的肽键 在酶法裂解肽链时，可适当的选取用一些化学药品来修饰某些氨基酸，以控制 酶的专一性，使所得的肽链片段更大一些。例如，用顺丁烯二酸酐或甲基顺丁烯二 酸酐修饰赖氨酸，则胰蛋白酶仅使精氨酸的羧基端肽键断裂，若用 1,2 或 1,3—二 羰基化合物修饰精氨酸，则胰蛋白酶仅能裂解赖氨酸羧基端肽键。当然，修饰后的 氨基酸还可以解封闭，解封闭后，酶仍能选择性的作用于这些氨基酸的肽键。目前 倾向于采用这种裂解方式。 (五)、肽段的分离 肽段的分离方法主要是凝胶过滤法，但单靠凝胶过滤法分离的肽段一般纯度不 够，常需辅以离子交换层析法进行纯化。将裂解后的肽段分离纯化后就逐一地进行 分析。 (六)、肽段的顺序分析
肽段的氨基酸顺序分析有化学法和酶解法两种 1.化学法 Edman降解法 这是目前用于顺序分析最主要的方法。它的原理是从N端开始,逐步降解 降解一个,分析一个。先将肽段与异硫氰酸苯酯(PH试剂】在p89的条件下 作用,肽段的游离N末端连接到异硫氰酸苯酯的原子上,生成苯异硫甲氨酰 肽,简称[C因。在强酸(三氟乙酸)作用下,可使靠近PTc基的氨基酸环化 肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物(APZ0和二个失去末端氨基酸的肽链,此肽链 不被破坏,因而又出现一个新的№一末端氨基酸。重复上述步骤,继续与PTH试剂 作用,继续分析。苯氨基噻唑啉酮衍生物用有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生 物很不稳定,在水中可转变为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH_氨基酸),此化合 物比较稳定,便于分析鉴定。反应过程如下: N=C=S+HNCH-CO一NHCH-CO一肽 异硫氰酸苯酯(PTH) 联反pH8-9 NH-C—NHCH-C0CH-CO—肽 苯异硫甲氨酰肽(PTC—肽) 坯新类 CF COOH(无水) R2 H-C RI 噻唑啉酮苯胺(ATz) 肽段(少一个氨基酸) IM HCI NH AZ 苯乙内酰硫脲氨基酸(PTH氨基酸)
13 肽段的氨基酸顺序分析有化学法和酶解法两种。 1．化学法—Edman 降解法 这是目前用于顺序分析最主要的方法。它的原理是从 N—端开始，逐步降解， 降解一个，分析一个。先将肽段与异硫氰酸苯酯（PTH 试剂）在 pH8—9 的条件下 作用，肽段的游离—NH2 末端连接到异硫氰酸苯酯的 C 原子上，生成苯异硫甲氨酰 肽，简称 PTC—肽。在强酸（三氟乙酸）作用下，可使靠近 PTC 基的氨基酸环化， 肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物(APZ0 和一个失去末端氨基酸的肽链，此肽链 不被破坏，因而又出现一个新的 N—末端氨基酸。重复上述步骤，继续与 PTH 试剂 作用，继续分析。苯氨基噻唑啉酮衍生物用有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生 物很不稳定，在水中可转变为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH—氨基酸），此化合 物比较稳定，便于分析鉴定。反应过程如下： R1 R2 N=C=S + H2N—CH—CO—NH—CH—CO—肽 异硫氰酸苯酯（PTH） 肽段 偶联反应 pH8—9 S R1 R2 NH—C—NH—CH—CO—CH—CO—肽 苯异硫甲氨酰肽（PTC—肽） 环化断裂 CF3COOH（无水） R2 NH—C S + H2N—CH—CO—肽 HN + C O CH R1 噻唑啉酮苯胺（ATZ） 肽段（少一个氨基酸） 转化反应 NH—C S N C S 1M HCl HN + C O O C NH CH CH R1 R1 ATZ 苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH—氨基酸）
这些步骤通常称为 Edman逐步降解法。 Edman逐步降解法的优点是样品用量少, 灵敏度高。PTH氨基酸可用各种层析法进行鉴定,如纸层析、薄层层析等。虽然 此方法具有很多优点,但由于操作繁琐,工作量大,所以,有人根据 Edman降解法 的原理作了一系列的改进。例如,1967年形成的液相顺序自动分析仪和1970年形 成的固相顺序分析仪都是在 Edman降解法的基础上进一步改进而成的。再如,1976 年有人将 Edman降解法的异硫氰酸苯酯试剂改为甲氨偶氮苯一异硫氰酸盐(简称 DABITC),这是一种有色试剂,产物 DARTH一氨基酸呈桔黄色,因此鉴定时不需要 染色,用肉眼即可分辩。此方法灵敏度高,是目前一种很可取的方法 2.藤解法 蛋白水解酶中有一类是肽链外切酶或称外肽酶,例如氨肽酶和羧肽酶,它们分 别从肽链的N端和C端逐个地向里切。因此,原则上只要能跟随酶水解的过程分别 定量测出释放的氨基酸,便能确定肽的顺序。但这种方法实际上有许多困难,局限 性很大,它只能用来测定末端附近很少几个残基的顺序。 另外,质谱法和气谱一质谱(GCMS)联用法也已用于肽链的氨基酸顺序分析 这是一种不同于 Edman降解法和酶解法的物理化学方法,具有一定的发展前途,但 目前应用还不十分普遍,其原理我们不再介绍 (七)、肽段的重迭重组 一但获得用两种不同方法断裂的肽段的全部氨基酸顺序后,就可用重迭重组的 方法确定出整条肽链的氨基酸排列顺序。肽段的重迭重组方法我们可通过下面的例 子来说明。实际工作中所得到的肽段远比下面的例子中的肽段大的多,但原理是 样的。 例如,有一个肽链,通过末端分析已知N一末端为丙氨酸,C一末端为缬氨酸 通过氨基酸组成分析已知其为十肽,假如先以糜蛋白酶水解,得一套肽段(A);再 以胰蛋白酶水解,则得到另一套肽段(B)。肽段的顺序分析结果如下 A:丙—苯丙+甘一赖一天冬酰胺一酪+精一色+组一缬 B:丙—苯丙—甘—赖十天冬酰胺一酪—精+色—组—缬 推理如下: 丙一苯丙 丙一苯丙一甘一赖 甘一赖一天冬酰胺一酪 天冬酰胺一酪一精 精一色 色一组一缬 组一缬 此十肽氨基酸顺序为:丙一苯丙一甘一赖一天冬酰胺一酪一精一色一组一缬 (八)、二硫键的定位
14 这些步骤通常称为 Edman 逐步降解法。Edman 逐步降解法的优点是样品用量少， 灵敏度高。PTH—氨基酸可用各种层析法进行鉴定，如纸层析、薄层层析等。虽然 此方法具有很多优点，但由于操作繁琐，工作量大，所以，有人根据 Edman 降解法 的原理作了一系列的改进。例如，1967 年形成的液相顺序自动分析仪和 1970 年形 成的固相顺序分析仪都是在 Edman 降解法的基础上进一步改进而成的。再如，1976 年有人将 Edman 降解法的异硫氰酸苯酯试剂改为甲氨偶氮苯—异硫氰酸盐（简称 DABITC），这是一种有色试剂，产物 DABTH—氨基酸呈桔黄色，因此鉴定时不需要 染色，用肉眼即可分辩。此方法灵敏度高，是目前一种很可取的方法。 2．酶解法 蛋白水解酶中有一类是肽链外切酶或称外肽酶，例如氨肽酶和羧肽酶，它们分 别从肽链的 N 端和 C 端逐个地向里切。因此，原则上只要能跟随酶水解的过程分别 定量测出释放的氨基酸，便能确定肽的顺序。但这种方法实际上有许多困难，局限 性很大，它只能用来测定末端附近很少几个残基的顺序。 另外，质谱法和气谱—质谱（GC—MS）联用法也已用于肽链的氨基酸顺序分析。 这是一种不同于 Edman 降解法和酶解法的物理化学方法，具有一定的发展前途，但 目前应用还不十分普遍，其原理我们不再介绍。 (七)、肽段的重迭重组 一但获得用两种不同方法断裂的肽段的全部氨基酸顺序后，就可用重迭重组的 方法确定出整条肽链的氨基酸排列顺序。肽段的重迭重组方法我们可通过下面的例 子来说明。实际工作中所得到的肽段远比下面的例子中的肽段大的多，但原理是一 样的。 例如，有一个肽链，通过末端分析已知 N—末端为丙氨酸，C—末端为缬氨酸， 通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，得一套肽段（A）；再 以胰蛋白酶水解，则得到另一套肽段（B）。肽段的顺序分析结果如下： A：丙—苯丙 + 甘—赖—天冬酰胺—酪 + 精—色 + 组—缬 B：丙—苯丙—甘—赖 + 天冬酰胺—酪—精 + 色—组—缬 推理如下： A—1 丙—苯丙 B—1 丙—苯丙—甘—赖 A—2 甘—赖—天冬酰胺—酪 B—2 天冬酰胺—酪—精 A—3 精—色 B—3 色—组—缬 A—4 组—缬 此十肽氨基酸顺序为：丙—苯丙—甘—赖—天冬酰胺—酪—精—色—组—缬 (八)、二硫键的定位