中文: 中国科学 科学通报 生物化学与生物物理学进展 生物化学与生物物理学学报 生命的化学 生物化学与分子生物学学报 微生物学报 遗传学报 实验生物学报 生物科学动态 日文: 科学 自然 生化学 蛋白质、核酸、酵素 英文 Nature(London) Science( Washington) Analytical Biochemistry (Nev Bidchemical Journal (London) Archives of Biochemistry and Biophysics (New York Biochemical and Biophysical Research Communications (New york Biochimica et Biophysica Acta(Amsterdam Biochemistry (USA) B Chemistry (London Biopolymers (New York) Biotechnology and Bioengineering(New York Canadian Journal of Biochemistry( Canada) Cancer Research (USA) Chromosome (Berlin) Comparative Biochemistry and Physiology (Oxford) Current Advances in Genetics and Molecular Biology (U.K) European Journal of Biochemistry(Heidelberg Enzyme (Basel) Experimental Cell Research( New York Federation Proceedings New York) General Cytochemical Methods (New York Immunology (Oxford) Indian Journal of Biochemistry(Indian) International Journal of Biochemistry (Oxford International Journal of Peptide and Protein Research( Copenhagen Journal of the Americal Society (Washington) Journal of Bacteriology (USA) Journal of Biochemistry(Tokyo Journal of Biological Chemistry (USA) Journal of Cell Biology(New York) Journal of Chromatography (USA) Journal of Electron Microscopy (Tokyo Journal of Experimental Biology (London) Journal of General Microbiology (london Journal of General Virology (London) Journal of Histochemistry and Cytochemistry (USA) Journal of Immunology (USA) Journal of Lipid Research (New York)
5 中文： 中国科学 科学通报 生物化学与生物物理学进展 生物化学与生物物理学学报 生命的化学 生物化学与分子生物学学报 微生物学报 遗传学报 实验生物学报 生物科学动态 日文： 科学 自然 生化学 蛋白质、核酸、酵素 英文： Nature（London） Science（Washington） Analytical Biochemistry（New York） Bidchemical Journal（London） Archives of Biochemistry and Biophysics（New York） Biochemical and Biophysical Research Communications（New york） Biochimica et Biophysica Acta（Amsterdam） Biochemistry（USA） Bioorganic Chemistry（London） Biopolymers（New York） Biotechnology and Bioengineering（New York） Canadian Journal of Biochemistry（Canada） Cancer Research（USA） Chromosoms（Berlin） Comparative Biochemistry and Physiology（Oxford） Current Advances in Genetics and Molecular Biology（U.K.） European Journal of Biochemistry（Heidelberg） Enzyme（Basel） Experimental Cell Research（New York） Federation Proceedings（New York） General Cytochemical Methods（New York） Immunology（Oxford） Indian Journal of Biochemistry（Indian） International Journal of Biochemistry（Oxford） International Journal of Peptide and Protein Research（Copenhagen） Journal of the Americal Society（Washington） Journal of Bacteriology（USA） Journal of Biochemistry（Tokyo） Journal of Biological Chemistry（USA） Journal of Cell Biology（New York） Journal of Chromatography（USA） Journal of Electron Microscopy（Tokyo） Journal of Experimental Biology（London） Journal of General Microbiology（london） Journal of General Virology（London） Journal of Histochemistry and Cytochemistry（USA） Journal of Immunology（USA） Journal of Lipid Research（New York）
Journal of Molecular Biology(London) Journal of Neurochemistry(London Journal of Theoretical Biology(London Journal of the Chemistry Society I Organic and bioorganic Chemistry (London Metabolism, Clinical and Experimental (USA) Molecular and Cellular Biochemistry(Hague Molecular and Cellular Genetics(Berlin) Molecular Pharmacology (New York Methods of Biochemical Analysis (New York Nucleic Acids Research (USA) Plant Physiology(USA) Peptides(USA) Preparative BIOchemistry (USA) Proceeding of the National Academy of Sciences( Washington Proceedings of the Royal Society of London, Series B(London) Protoplasma ( Vienna) Steroids( San Fradsisco) TBS (USA) Virology(New York) 德文 Die Naturwissenschaften ( Berli Biochemische Zerischrift( Berlin) Zeitschrift fur Naturforschung 法文: Comptes Rendus hebdomadaires des Seances de LAcademie des sciences ( Paris)
6 Journal of Molecular Biology（London） Journal of Neurochemistry（London） Journal of Theoretical Biology（London） Journal of the Chemistry Society I.Organic and Bioorganic Chemistry（London） Journal of Virology（Washington）] Metabolism，Clinical and Experimental（USA） Molecular and Cellular Biochemistry（Hague） Molecular and Cellular Genetics（Berlin） Molecular Pharmacology（New York） Methods of Biochemical Analysis（New York） Nucleic Acids Research（USA） Plant Physiology（USA） Peptides（USA） Preparative BIOchemistry（USA） Proceeding of the National Academy of Sciences（Washington） Proceedings of the Royal Society of London，Series B（London） Protoplasma（Vienna） Steroids（San Fradsisco） TBS（USA） Virology（New York） 德文： Die Naturwissenschaften（Berlin） Biochemische Zerischrift（Berlin） Zeritschrift fur Naturforschung 法文： Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de L′Academie des Sciences（Paris）
第二章蛋白质生物化学 蛋白质生物化学研究的是蛋白质的结构、性质、和功能及结构与功能的关系 生物体最重要的组成物质是蛋白质和核酸。核酸是遗传大分子,负责遗传信息的储 存与传递。蛋白质是功能大分子,是生物体的结构、性质与功能的具体体现者。例 如:遗传信息的复制、传递和表达要依靠各种蛋白质才能完成;细胞的骨架是由许 多种蛋白质构成的三维网状结构,而细胞的各种生命活动都是在细胞骨架上进行 的:生命的运动依赖于各种运动蛋白:氧的运输要靠血红蛋白来完成;动物体对疾 病的抵抗力是由免疫球蛋白执行的;细胞能够认识“自己”与“非己”,是靠糖蛋 白的特殊功能:机体的代谢活动要依赖各种酶和激素来完成,酶是蛋白质,激素中 有相当一部分是肽类。可见蛋白质在生命活动中无所不在,无时无刻不在发挥着重 要功能。近年来发现的羊的瘙痒病( Scrapie)的病因是一种最简单的具有感染性的 蛋白因子( Prion)引起的,它是比类病毒还小的微生物,未检査出其含有核酸物 质,而只是一种蛋白质颗粒。这是值得人们思考的问题。 要研究蛋白质的功能,首先必须深入了解它们的结构,特别是空间结构(三维 结构),因为结构决定功能,生命物质的功能和它的结构二者是统一的,有什么样 的结构必有什么样的功能,反之亦然。例如,酶蛋白的催化功能只有在彻底弄清酶 的活性中心与底物如何结合,并如何反应,才真正了解那种酶的作用机理。再如 在彻底弄清楚血红蛋白的分子构象及与氧分子结合后的构象的变化之后,才能完整 地阐述动物机体中氧和二氧化碳的运载过程。因此,我们本章中首先介绍蛋白质结 构原理的最新进展,然后再介绍几类蛋白质的结构与功能的关系及其它的有关 蛋白质的结构很早就受到科学家的关注,但在50年代以前一直未能得到满意 的结果。直到1952年丹麦生物化学家林德斯洛姆一兰( Linderstrom-lang)第 次提出蛋白质结构的三级结构的概念,才使蛋白质结构的研究走上了正确的道路。 Linderstrom-lang的三级结构概念是:二级结构是指多肽链中氨基酸的顺序,而丕 涉及其空间排列状态;二级结构是指多肽链骨架(主链)的局部空间结 涉及 链构象,也不考虑与其它肽链片段之间的关系及整个肽链的空间排列状况:三级 结构是指整个肽链的折迭情况,或者说是指肽链中全部原子在空间的排列状态。这 概念一提出来,立即得到了科学家的认同。1958年,英国晶体学家在研究蛋白 质晶体时发现,有些蛋白质是由几条相同或不同的肽链组成,每条肽链都有完整的 三级结构,称之为亚基,几个亚基排列成空间几何状态,并匪共价键结合在二 起。他将这种结构称为四级结构。现在蛋白质的 三、四级结构的概念已由 国际生化协会(IUB)的生化命名委员会采纳并作出正式定义。到目前为止已有2000 多种蛋白质的一级结构被搞清楚。据1990年4月的统计,有488种蛋白质的三级 结构利用ⅹ—射线衍射技术在不同分辨率水平上得到了阐明。蛋白质三维结构的研 究资料大大丰富了人们对蛋白质空间结构规律的认识,同时,蛋白质四级结构水平 的概念也已不能满足人们的要求。因此,近年来蛋白质化学家又在四级结构水平
7 第二章 蛋白质生物化学 蛋白质生物化学研究的是蛋白质的结构、性质、和功能及结构与功能的关系。 生物体最重要的组成物质是蛋白质和核酸。核酸是遗传大分子，负责遗传信息的储 存与传递。蛋白质是功能大分子，是生物体的结构、性质与功能的具体体现者。例 如：遗传信息的复制、传递和表达要依靠各种蛋白质才能完成；细胞的骨架是由许 多种蛋白质构成的三维网状结构，而细胞的各种生命活动都是在细胞骨架上进行 的；生命的运动依赖于各种运动蛋白；氧的运输要靠血红蛋白来完成；动物体对疾 病的抵抗力是由免疫球蛋白执行的；细胞能够认识“自己”与“非己”，是靠糖蛋 白的特殊功能；机体的代谢活动要依赖各种酶和激素来完成，酶是蛋白质，激素中 有相当一部分是肽类。可见蛋白质在生命活动中无所不在，无时无刻不在发挥着重 要功能。近年来发现的羊的瘙痒病（Scrapie）的病因是一种最简单的具有感染性的 蛋白因子（Prion）引起的，它是比类病毒还小的微生物，未检查出其含有核酸物 质，而只是一种蛋白质颗粒。这是值得人们思考的问题。 要研究蛋白质的功能，首先必须深入了解它们的结构，特别是空间结构（三维 结构），因为结构决定功能，生命物质的功能和它的结构二者是统一的，有什么样 的结构必有什么样的功能，反之亦然。例如，酶蛋白的催化功能只有在彻底弄清酶 的活性中心与底物如何结合，并如何反应，才真正了解那种酶的作用机理。再如， 在彻底弄清楚血红蛋白的分子构象及与氧分子结合后的构象的变化之后，才能完整 地阐述动物机体中氧和二氧化碳的运载过程。因此，我们本章中首先介绍蛋白质结 构原理的最新进展，然后再介绍几类蛋白质的结构与功能的关系及其它的有关问 题。 蛋白质的结构很早就受到科学家的关注，但在 50 年代以前一直未能得到满意 的结果。直到 1952 年丹麦生物化学家林德斯洛姆—兰（Linderstrom—lang）第一 次提出蛋白质结构的三级结构的概念，才使蛋白质结构的研究走上了正确的道路。 Linderstrom—lang 的三级结构概念是：一级结构是指多肽链中氨基酸的顺序，而不 涉及其空间排列状态；二级结构是指多肽链骨架（主链）的局部空间结构，不涉及 侧链构象，也不考虑与其它肽链片段之间的关系及整个肽链的空间排列状况；三级 结构是指整个肽链的折迭情况，或者说是指肽链中全部原子在空间的排列状态。这 一概念一提出来，立即得到了科学家的认同。1958 年，英国晶体学家在研究蛋白 质晶体时发现，有些蛋白质是由几条相同或不同的肽链组成，每条肽链都有完整的 三级结构，称之为亚基，几个亚基排列成空间几何状态，并靠非共价键结合在一 起。他将这种结构称为四级结构。现在蛋白质的一、二、三、四级结构的概念已由 国际生化协会（IUB）的生化命名委员会采纳并作出正式定义。到目前为止已有 2000 多种蛋白质的一级结构被搞清楚。据 1990 年 4 月的统计，有 488 种蛋白质的三级 结构利用 X—射线衍射技术在不同分辨率水平上得到了阐明。蛋白质三维结构的研 究资料大大丰富了人们对蛋白质空间结构规律的认识，同时，蛋白质四级结构水平 的概念也已不能满足人们的要求。因此，近年来蛋白质化学家又在四级结构水平的
基础上增加了两种新的结构水平,即超二级结构和结构域。超二级结构是1973年 罗斯曼( Rossman)提出的,是指蛋白质结构中存在的各种二级结枃组合物,是枃 成三级结构的构件。结构域的概念是由免疫化学家波特( Porter)提出的,是指蛋 自质分子中那些明显分开的球状部分。例如,动物的免疫球蛋白(lgG)含有1 个结构域。现已证明许多蛋白质含有明显的结构域。这两种新的蛋白质结构概念目 前已被生物化学家及分子生物学家所公认。所以,我们所提到的蛋白质结构应包括 六级水平的结构。即: 级结构→二级结构→超二级结构亠结构域→三级结构亠四级结构 蛋白质三维结构的深入研究,不仅从分子水平上深入揭示了生命的奥秘,而且 可用于生产实践。例如,80年代兴起的蛋白质工程技术,就是利用现代生物技术 改造蛋白质的分子结构,提高其生物活性,使其更加符合人类的需要。所以,将蛋 白质生物化学的理论知识应用于生产实践,必将对人类做出更大的贡献。 第一节蛋白质的一级结构 蛋白质一级结构的内容 蛋白质是不分枝的生物大分子,由20种氨基酸组成(从各种生物体中发现的 氨基酸有180种,参与蛋白质组成的基本氨基酸有20种,称为蛋白氨基酸,其它 的称为非蛋白氨基酸),氨基酸在多肽链中有一定的排列顺序,蛋自质的一级结构 就是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。蛋白质一级结构也称为蛋白质的共价结 构。当然,蛋白质一级结构中还应包括二硫键 。蛋白质一级结构包括以下几 个内容 1.蛋白质分子中多肽链的数目 2.每一条多肽链末端氨基酸的种类; 3.每一条多肽链中氨基酸的种类、数目和排列顺序; 4.链内二硫键的位置和数目: 5.链间二硫键的位置和数目。 研究蛋白质一级结构就是要研究这些内容 蛋白质一级结构的表示方法一般是从左到右表示多肽链从氨基端到羧基端。氨 基酸的种类和排列顺序通常用三字母表示,即氨基酸英文名称的前三个字母。但为 了更加方便,国际生化委员会推荐了一套单字母表示法。 蛋白质一级结构的测定 1955年,英国生物化学家桑格( Sanger)首先完成了胰岛素一级结构的分析, 为蛋白质一级结构的研究开辟了道路。但这项工作花费了他整整十年的时间。随后, 唉德曼( Edman)液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱一质谱 (GCMS)等方法相继出现,使蛋白质一级结构的分析速度大大加快。现在分析 个分子量在10万左右的蛋白质只需要几天的时间就可完成。蛋白质一级结构分析
8 基础上增加了两种新的结构水平，即超二级结构和结构域。超二级结构是 1973 年 罗斯曼（Rossman）提出的，是指蛋白质结构中存在的各种二级结构组合物，是构 成三级结构的构件。结构域的概念是由免疫化学家波特（Porter）提出的，是指蛋 白质分子中那些明显分开的球状部分。例如，动物的免疫球蛋白（IgG）含有 12 个结构域。现已证明许多蛋白质含有明显的结构域。这两种新的蛋白质结构概念目 前已被生物化学家及分子生物学家所公认。所以，我们所提到的蛋白质结构应包括 六级水平的结构。即： 一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→四级结构 蛋白质三维结构的深入研究，不仅从分子水平上深入揭示了生命的奥秘，而且 可用于生产实践。例如，80 年代兴起的蛋白质工程技术，就是利用现代生物技术 改造蛋白质的分子结构，提高其生物活性，使其更加符合人类的需要。所以，将蛋 白质生物化学的理论知识应用于生产实践，必将对人类做出更大的贡献。 第一节 蛋白质的一级结构 一、蛋白质一级结构的内容 蛋白质是不分枝的生物大分子，由 20 种氨基酸组成（从各种生物体中发现的 氨基酸有 180 种，参与蛋白质组成的基本氨基酸有 20 种，称为蛋白氨基酸，其它 的称为非蛋白氨基酸），氨基酸在多肽链中有一定的排列顺序，蛋白质的一级结构 就是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。蛋白质一级结构也称为蛋白质的共价结 构。当然，蛋白质一级结构中还应包括二硫键的定位。蛋白质一级结构包括以下几 个内容： 1．蛋白质分子中多肽链的数目； 2．每一条多肽链末端氨基酸的种类； 3．每一条多肽链中氨基酸的种类、数目和排列顺序； 4．链内二硫键的位置和数目； 5．链间二硫键的位置和数目。 研究蛋白质一级结构就是要研究这些内容。 蛋白质一级结构的表示方法一般是从左到右表示多肽链从氨基端到羧基端。氨 基酸的种类和排列顺序通常用三字母表示，即氨基酸英文名称的前三个字母。但为 了更加方便，国际生化委员会推荐了一套单字母表示法。 二、蛋白质一级结构的测定 1955 年，英国生物化学家桑格（Sanger）首先完成了胰岛素一级结构的分析， 为蛋白质一级结构的研究开辟了道路。但这项工作花费了他整整十年的时间。随后， 唉德曼（Edman）液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱—质谱 （GC—MS）等方法相继出现，使蛋白质一级结构的分析速度大大加快。现在分析一 个分子量在 10 万左右的蛋白质只需要几天的时间就可完成。蛋白质一级结构分析
的综述和专著文献很多,在此我们只作简要的概述。 蛋白质一级结构分析的基本步骤如下; 1.蛋白质样品的纯化 2.测定N一末端和C一末端氨基酸 3.至少以两种方式裂解肽链成肽段; 4.肽段的分离纯化 5.肽段的顺序分析 6.肽段重迭重组以确定肽链的全部氨基酸顺 7.二硫键的定位。 (一)、蛋白质的纯化(均一) 在测定蛋白质的一级结构之前,首先必须保证被测蛋白质样品的纯度,只有均 一的蛋白质样品,才能保证顺序测定结果准确可靠:其次要了解它的分子量和亚基 数。如果某些蛋白质分子是由两个以上的肽链组成的,第一步必须将多肽链分开。 蛋白质多肽链之间有非共价键和共价键(二硫键)作用力。如果只有非共价键,可 用脲或盐酸胍等变性剂将其分开。如果肽链之间有二硫键,则需要用拆开二硫键的 方法进行处理。拆开二硫键的化学方法主要有以下两种 1.过甲酸氧化法 用过甲酸(过氧化氢+甲酸)可使蛋白质分子中的二硫键断裂。反应一般在0℃ 下进行2小时左右,就能使二硫键中的两个硫全部转变为磺酸基。这样被氧化的半 胱氨酸称为磺基丙氨酸。反应如下: . S-Ch2 COOOH、0℃ NHCHCO一 NHCHCO一 如果蛋白质分子中同时存在半胱氨酸,那么也会被氧化成磺基丙氨酸。此外 甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化,从而增加了分析的复杂性。 2.巯基乙醇原法 利用巯基乙醇亦可使蛋白质中二硫键断裂。高浓度的巯基乙醇在pH8-9、室 温下作用数小时后,可二硫键定量的还原为_SH。在此反应系统中还需加入8M 脲或6M盐酸胍使蛋白质变性,多肽链松散成为无规则的构象,从而有利于巯基乙 醇作用于二硫键。此反应是可逆的,因此要使反应完全,巯基乙醇的浓度必需保持 在0.1-0.5M。反应如下 -NICHE COH脲或6M盐酸2CH-sHCH25-S-H2 -NHCHCO- CH-OH HOCH 被还原生成的一SH不稳定,极易被重新氧化生成—S—S—,故需要稳定。稳 定一SH的方法通常是用碘乙酸(ICH2COO)使一SH羧甲基化(SHCH2COO) 9
9 的综述和专著文献很多，在此我们只作简要的概述。 蛋白质一级结构分析的基本步骤如下； 1．蛋白质样品的纯化； 2．测定 N—末端和 C—末端氨基酸； 3．至少以两种方式裂解肽链成肽段； 4．肽段的分离纯化； 5．肽段的顺序分析； 6．肽段重迭重组以确定肽链的全部氨基酸顺序； 7．二硫键的定位。 (一)、蛋白质的纯化（均一） 在测定蛋白质的一级结构之前，首先必须保证被测蛋白质样品的纯度，只有均 一的蛋白质样品，才能保证顺序测定结果准确可靠；其次要了解它的分子量和亚基 数。如果某些蛋白质分子是由两个以上的肽链组成的，第一步必须将多肽链分开。 蛋白质多肽链之间有非共价键和共价键（二硫键）作用力。如果只有非共价键，可 用脲或盐酸胍等变性剂将其分开。如果肽链之间有二硫键，则需要用拆开二硫键的 方法进行处理。拆开二硫键的化学方法主要有以下两种： 1．过甲酸氧化法 用过甲酸（过氧化氢+甲酸）可使蛋白质分子中的二硫键断裂。反应一般在 0℃ 下进行 2 小时左右，就能使二硫键中的两个硫全部转变为磺酸基。这样被氧化的半 胱氨酸称为磺基丙氨酸。反应如下： CH2 S S CH2 HCOOOH、0℃、2h CH2—SO3H 2 —NHCHCO— —NHCHCO— —NHCHCO— 如果蛋白质分子中同时存在半胱氨酸，那么也会被氧化成磺基丙氨酸。此外， 甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，从而增加了分析的复杂性。 2．巯基乙醇原法 利用巯基乙醇亦可使蛋白质中二硫键断裂。高浓度的巯基乙醇在 pH8—9、室 温下作用数小时后，可二硫键定量的还原为—SH。在此反应系统中还需加入 8M 脲或 6M 盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散成为无规则的构象，从而有利于巯基乙 醇作用于二硫键。此反应是可逆的，因此要使反应完全，巯基乙醇的浓度必需保持 在 0.1—0.5M。反应如下： CH2 S S CH2 CH2SH pH8-9、室温、数小时 CH2—SH CH2 S S CH2 +2 2 + —NHCHCO- -NHCHCO— CH2OH 8M 脲或 6M 盐酸胍 —NHCHCO— CH2OH HOCH2 被还原生成的—SH 不稳定，极易被重新氧化生成—S—S—，故需要稳定。稳 定—SH 的方法通常是用碘乙酸（ICH2COO-）使—SH 羧甲基化（—SHCH2COO-）