外源基因在大肠杆菌中的高效表达(a)An inducible geneRegutatory chemical....switchesGene normallyoffthegene onGenePromoterXTranscriptsNotranscription(a) A strong promoterGeneTranscriptionufStrongpromoter3R88TranslationRNumeroustranscripts0(b)AweakpromoterNumerousproteinGenemoleculesTranscriptionWeakpromoterTranslationRelatively fewtranscriptsLownumberofprotein molecules
外源基因在大肠杆菌中的高效表达
一：实验目的1.掌握外源基因在大肠杆菌中表达的特点和方法。2.复习SDS-PAGE的制备及其分离蛋白的原理。实验原理二.大肠杆菌表达体系1.基因表达调控的分子机制清楚2.使用安全，有多种适用的寄主菌株和载体；3.多数克隆的外源基因都可高效表达：4.培养方便、操作简单、成本低，易于批量生产。不足在大肠杆菌中表达的蛋白可能缺少特定等翻译后加工常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象
一．实验目的 1.掌握外源基因在大肠杆菌中表达的特点和方法。 2.复习SDS-PAGE的制备及其分离蛋白的原理。 不足 在大肠杆菌中表达的蛋白可能缺少特定等翻译后加工， 常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 1. 基因表达调控的分子机制清楚； 2. 使用安全，有多种适用的寄主菌株和载体； 3. 多数克隆的外源基因都可高效表达； 4. 培养方便、操作简单、成本低，易于批量生产。 二．实验原理 大肠杆菌表达体系
三：大肠杆菌表达的一般流程获得目的基因月→准备表达载体一→将目的基因插入表达载体中（测序验证）常用表达载体：具有以下几种元件：1.可控转录的启动子；类型：Plac,Ptac,PT7,PT5,eto2.转录调控序列（转录终止子，核糖体结合位点）；3.一个多克隆限制酶切位点；4.选择标志的编码序列；类型：AmpR,KanR,eto5.宿主体内自主复制的序列。融合表达蛋白标签：GST,6xHis,MBP,GFP,etcpGEX系列(tacpromoterGST融合表达）pET系列(T7 promoter, 6XHis)pQE系列(T5 promoter, 6XHis)
三．大肠杆菌表达的一般流程 获得目的基因 → 准备表达载体 → 将目的基因插 入表达载体中（测序验证） 常用表达载体： 融合表达蛋白标签: GST, 6xHis, MBP, GFP, etc pGEX系列 (tac promoter, GST融合表达) pET系列 (T7 promoter, 6XHis) pQE系列 (T5 promoter, 6XHis) 类型: Plac, Ptac, PT7, PT5, etc 具有以下几种元件： 1. 可控转录的启动子； 2. 转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； 3. 一个多克隆限制酶切位点； 4. 选择标志的编码序列； 5. 宿主体内自主复制的序列。 类型: AmpR , KanR , etc
原核生物的基因转录调控-乳糖操纵子P,lacTiacRepressorActivatorbinding sitebinding site(operator)DNAlacBACPromoterRNANOlacmRNANOP-laclTiaclPolymeraselactose阻遏物DNAlaclGeneofyourinterestsPromoterRNAP.laclTiaclPolymeraselacmRNALactose去阻遏Lactose
原核生物的基因转录调控-乳糖操纵子 Lactose NO lactose NO lac mRNA Lactose RNA Polymerase RNA Polymerase lac mRNA Gene of your interests 阻遏物 去阻遏
PharmaciapGEX-6P-3(27-4599-01)多克隆限制酶切位点PreScissionProteaseILeuGlu Val LeuPheGlnGly ProlLeu Gly Ser Pro Asn SerArg Val Asp Ser Ser Gly ArgCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCCCGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCSallBamHIEcoRINotiSmalXholTth1111AatilN'GSThioneS-transferaseitathPtacaAmprBspMIpSj10ABam7Stop7PstIPGEX~4900bpNarlAWNIlac/qEcoRVP4.5BssH IIApalPBR322BstEIllMlu I自主复制序列
Pharmacia lacIq 多克隆限制酶切位点 Ptac N’ GST Ampr 自主复制序列