DNA分子的体外连接一：实验目的及背景·在一定条件下DNA连接酶催化两个双链DNA片段相的5端磷酸与3端羟基之间形成磷酸酸脂键.DNA分子的接是在酶切反应获得互补序列基础上进行的。常用的两种DNA连接酶：(1）大肠杆菌的DNA连接酶(2)噬菌体的T.DNA连接酶。·DNA连接酶的最适反应温度为37℃C，但在此温度下，粘性末未端的氢键结合很不稳定，折衷方法是12℃过夜
DNA分子的体外连接 一．实验目的及背景 • 在一定条件下,DNA连接酶催化两个双链DNA片段相 邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸酸脂键,DNA分 子的连接是在酶切反应获得互补序列基础上进行的。 常用的两种DNA连接酶： (1) 大肠杆菌的DNA连接酶, (2) 噬菌体的T4DNA连接酶。 • DNA连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度 下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是12℃ 过夜
·DNA的未端性质由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性未端，因而连接反应中就有平末端连接和粘性末端连接。粘性末端连接效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上有差异。·碱性磷酸酶处理质粒载体为提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，来增加重组子比例，可是这又会引起DNA自身连接的问题。为此，通常选择对载体进行碱性磷酸酶处理，除去其5'未端的磷酸基，防止自身环化。·连接反应的检测连接反应成功与否，要通过下一步实验，转化宿主菌，对阳性克隆的筛选来确定
• DNA的末端性质 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因 而连接反应中就有平末端连接和粘性末端连接。 粘性末 端连接效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上有差异。 • 碱性磷酸酶处理质粒载体 为提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，来增加 重组子比例，可是这又会引起DNA自身连接的问题。为 此，通常选择对载体进行碱性磷酸酶处理，除去其5’末端 的磷酸基，防止自身环化。 • 连接反应的检测 连接反应成功与否，要通过下一步实验，转化宿主菌， 对阳性克隆的筛选来确定
二、实验试剂1.纯化后的酶切质粒载体和目的基因。2.10XTDNA连接酶buffer200mMTris-HCI(pH7.6)50mMMgCI250mM二硫糖醇500μl/mlBSA3.TDNA连接酶三、实验步骤胶回收载体（EcoRI/HindII）3 μl (~50ng)连接反应：胶回收插入片段（EcoRI/Hind）5.5μl（~50ng）T4 DNA Ligase0.5ul10xbuffer1 μl总体积(两人一组）10 μl盖上管盖，混匀，台式离心机上离心5秒。20℃连接1小时。反应结束后于-20℃保存
二、实验试剂 1. 纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 2. 10× T4 DNA连接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇 500μl/ml BSA 3. T4 DNA连接酶 三、实验步骤 胶回收载体（EcoR I /HindIII ） 3 µl（~50ng） 胶回收插入片段（EcoR I /HindIII ） 5.5 µl （~50ng） T4 DNA Ligase 0.5ul10X buffer 1 µl 总体积 10 µl （两人一组） 盖上管盖，混匀，台式离心机上离心5秒。20℃ 连接1小时。反应结束后于-20℃保存。 连接反应：
四、问题与讨论：1.简述T4DNA连接酶作用机理2.简述一个完整外源DNA的克隆过程3.连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率
四、问题与讨论： 1. 简述T4 DNA连接酶作用机理。 2. 简述一个完整外源DNA的克隆过程。 3. 连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率
感受态细胞的制备与DNA的转化一：实验目的及背景（一）什么是感受态细胞（Competent cell）？细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态，经特殊处理后处于此状态的细胞称感受态细胞（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。（3）受体细胞为限制修饰酶缺陷型，使转入的DNA分子不易被切除或破坏
感受态细胞的制备与DNA的转化 （1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以 溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。 （2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透 性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。 （3）受体细胞为限制修饰酶缺陷型，使转入的DNA分 子不易被切除或破坏。 (一) 什么是感受态细胞（Competent cell ）？ 细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态，经 特殊处理后处于此状态的细胞称感受态细胞。 一．实验目的及背景