5.蛋白质-DNA杂交法 1)原理 利用某些基因产物可与DNA分子上特异序列结合的特点 分离那些参与基因表达调控的基因 DNA探针可以是调控蛋白结合的序列,其长度尽可能短 且能获得杂交斑点。小于150bp的DNA探针可大大降低非 特异性结合。DNA探针必须是双链,否则会导致大量的非 特异性结合。 必要条件:目的基因或cDNA必须在宿主细胞中表达 2)操作步骤 基因文库→制备蛋白质样品膜→与标记DNA探针→阳性 克隆一序列测定→基因表达→蛋白质DNA结合实验 特异性DNA序列分析和进一步确证实验(足迹分析技术等)
5. 蛋白质-DNA杂交法 1) 原理 利用某些基因产物可与DNA分子上特异序列结合的特点 分离那些参与基因表达调控的基因 DNA探针可以是调控蛋白结合的序列，其长度尽可能短 且能获得杂交斑点。小于150bp的DNA探针可大大降低非 特异性结合。DNA探针必须是双链，否则会导致大量的非 特异性结合。 必要条件：目的基因或cDNA必须在宿主细胞中表达 2) 操作步骤 基因文库 → 制备蛋白质样品膜 → 与标记DNA探针 → 阳性 克隆 →序列测定 → 基因表达→ 蛋白质-DNA结合实验 → 特异性DNA序列分析和进一步确证实验（足迹分析技术等）
6.蛋白质-蛋白质结合法-酵母双杂交法 1)原理 利用酿酒酵母的GAL4蛋白质N端和C-端分别融合 的两种蛋白质相互作用可激活具有UAS( upstream activating sequence,上游激活序列)报告基因表达筛 选目的基因的方法。 i.GAL4蛋白质是一个调控基因,控制半乳糖利用酶类 基因的表达,这些基因的5端存在UAS序列; GAL4存在两个结构域:N端(1-147)具有 UAS-DNA 结合域(DNA- binding domain,BD,C-端(7688)具有 转录激活结构域( ranscriptional activation domain, AD)。这两个结构域可以单独起作用
6. 蛋白质-蛋白质结合法---酵母双杂交法 1) 原理 利用酿酒酵母的GAL4蛋白质N-端和C-端分别融合 的两种蛋白质相互作用可激活具有UAS（upstream activating sequence，上游激活序列）报告基因表达筛 选目的基因的方法。 i. GAL4蛋白质是一个调控基因，控制半乳糖利用酶类 基因的表达，这些基因的5’-端存在UAS序列； ii. GAL4存在两个结构域：N-端(1-147)具有UAS-DNA 结合域(DNA-binding domain, BD), C-端(768-881)具有 转录激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。这两个结构域可以单独起作用
GAL 4 AD GAL 4 Transcription DNA-BD GALI UAS Promoter GALI 酵母的双杂交系统示意图 Protein X GALA AD GAL 4 protein DNA-BD GAL 4 AD Protein X Protein Y GAL 4 transcripTion DNA-BD GAL 1 UAS Promoter LacZ(or HIS3) reporter gene
GAL 1 UAS Transcription DNA-BD GAL 4 GAL 4 AD Promoter GAL1 GAL 1 UAS Transcription Protein X DNA-BD Protein Y GAL 4 GAL 4 AD Promoter LacZ(or HIS3) reporter gene protein Y GAL4 AD GAL 4 DNA-BD Protein X 酵母的双杂交系统示意图