第七节 分子杂交技术
第七节 分子杂交技术
分子杂交种类 1.按其分子种类划分 1)DNA杂交一探针为DNA或RNA 2)RNA杂交一探针为DNA或cDNA DNA 日E ⊥LLL DNA或cDNA RNA 3)蛋自质免疫分析一探针为抗体 B二抗一酶E▲B二抗一酶B 蛋白质
一 . 分子杂交种类 1. 按其分子种类划分 1） DNA杂交—探针为DNA或RNA 2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA RNA DNA DNA RNA 3） 蛋白质免疫分析—探针为抗体 蛋白质
2.按样品制备过程划分 1)原位杂交( Gin situ hybridization i.原位菌落杂交 原位噬菌斑杂交 原位细胞杂交 iv原位组织块杂交 原位裂解细胞,不需要分离DNA,RNA或蛋白质样品,可 同时处理大量样品,常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或 组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。 2)斑点杂交( dot hybridization 先分离DNA,RNA或蛋白质,然后将样品液直接点在 固体基质上进行杂交,不能测定分子量大小
2. 按样品制备过程划分 1） 原位杂交(in situ hybridization) i. 原位菌落杂交 ii. 原位噬菌斑杂交 iii. 原位细胞杂交 iv. 原位组织块杂交 原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可 同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或 组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。 2）斑点杂交(dot hybridization) 先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在 固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小
3)转移杂交或印迹杂交( blotting hybridization 先纯化样品,然后使不同大小的分子在凝胶上分离,转移到 固体基质上,与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。 用于转移的方法有: i.扩散法 i.毛细管法 i电泳转移法 ⅳv.真空转移法 4)夹心杂交法( (sandwich hybridization) 它利用两种探针与待测DNA结合,先将不带 标记的探针固定在基质上,然后用待测样品 与之杂交,洗去非特异性结合后,再与第二 种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制 DNA样品,可检测出02ng的DNA样品
3）转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization) 先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到 固体基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。 用于转移的方法有： i. 扩散法 ii. 毛细管法 iii. 电泳转移法 iv. 真空转移法 4) 夹心杂交法(sandwich hybridization) * 它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带 标记的探针固定在基质上，然后用待测样品 与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二 种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制 DNA样品，可检测出0.2ng的DNA样品
3.分子杂交的一般程序 1)DNA和RNA的杂交 制备DNA或RNA样品与固定基质结合80℃真空固定→ 预杂交→加入标记探针杂交洗涤放射自显影或显色反应。 2)蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品→与固定基质结合常温空气中固定→封闭 剂封闭→一抗反应一洗涤二抗-酶偶联物反应洗涤显色反 应(EIA) 或→一抗放射标记物洗涤→放射自显影(RIA 杂交样品膜的制备 1.固定基质的种类与特性 1)硝酸纤维素滤膜( Nitrocellulose filter,NCF) 可与三类大分子的结合,其机理不清楚,可能为被动吸附。 NCF不能结合小分子DNA,RNA和蛋白质(<20,000
3. 分子杂交的一般程序 1) DNA和RNA的杂交 制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→ 预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。 2）蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封闭 剂封闭→一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色反 应（EIA） 或 → 一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA） 二. 杂交样品膜的制备 1. 固定基质的种类与特性 1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。 NCF不能结合小分子DNA，RNA和蛋白质（<20,000）