获得基因的一般方法 1.化学合成方法 主要用于较小基因的合成,或需改变密码子的基因。 2.半化学合成法 mRNA→CDNA→加人工接头或合成一段DNA→ 与载体相连 3.筛选法 用于各种方法从基因组文库或cDNA文库中选择目 的基因
一．获得基因的一般方法 1. 化学合成方法 主要用于较小基因的合成，或需改变密码子的基因。 2. 半化学合成法 mRNA → cDNA → 加人工接头或合成一段DNA → 与载体相连 3. 筛选法 用于各种方法从基因组文库或cDNA文库中选择目 的基因
二.基因的筛选方法 1.遗传互补法 1)原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后,如果受体 细胞获得某种新的性状,那么此片段上携带着决定新性 状的遗传基因。 i.营养缺陷型受体细胞外源DNA→转化细胞涂布 在合成培养基上→原养型细胞生长 i受体细胞(无某种表型)+外源DNA→转化细胞 涂布在特殊培养基上→具有新性状细胞 ⅲ虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性,但当转 入目的基因后,该细胞可过量产生此酶活性,这亦可用
二．基因的筛选方法 1. 遗传互补法 1) 原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体 细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性 状的遗传基因。 i. 营养缺陷型受体细胞+外源DNA → 转化细胞涂布 在合成培养基上→ 原养型细胞生长 ii. 受体细胞（无某种表型）+ 外源DNA → 转化细胞 涂布在特殊培养基上→ 具有新性状细胞 iii. 虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转 入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用
于基因筛选。如酿酒酵母的MFa基因就是如此筛选到的 实例:基因组文库DNA→转化酿酒酵母细胞(le2,eu) 转化细胞(leu2/EU2,Leut)LEU基因 基因组文库DNA一转化Ecoi(无纤维素酶活性)→ 转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈一纤维素酶基因 优点:简便,快速,可靠,是首选方法。获得的基因 定是完整基因。 缺点:适用范围较窄。 必备条件:外源基因不仅能在受体细胞表达,而且必 须具备生物学活性
实例：基因组文库DNA → 转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-） → 转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因 基因组文库DNA →转化E.coli（无纤维素酶活性）→ 转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈 →纤维素酶基因 优点：简便，快速，可靠，是首选方法。获得的基因 一定是完整基因。 缺点：适用范围较窄。 必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必 须具备生物学活性。 于基因筛选。如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的
2)分离步骤 分离基因组文库重组DNA分子→转化适当宿主细胞→涂布在 选择培养基上一随机挑选阳性克隆,分离重组DNA分子一再转 化相同受体细胞→高频转化子一基因的进一步证实和鉴定 重组DNA转化细胞 SDS-PAGE→出现新蛋白质带 原载体转化细胞(分别制备无细胞抽提物酶活测定酶活性出现 非转化细胞(二) 免疫分析与特定抗原反应 鉴定工作包括:限制酶图谱,基因定位, Southern杂交, 序列测定
2) 分离步骤 分离基因组文库重组DNA分子→ 转化适当宿主细胞 → 涂布在 选择培养基上→随机挑选阳性克隆，分离重组DNA分子→再转 化相同受体细胞→ 高频转化子→基因的进一步证实和鉴定 重组DNA转化细胞 SDS-PAGE →出现新蛋白质带 原载体转化细胞(一) 分别制备无细胞抽提物 酶活测定→酶活性出现 非转化细胞（二） 免疫分析→与特定抗原反应 鉴定工作包括：限制酶图谱，基因定位，Southern杂交, 序列测定
2.核酸杂交法 1)原理 利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交 的特点分离目的基因(同源序列不是完全相同序列) 优点:不需要基因表达 必备条件:合适的核酸探针或有关资料,外源DNA能在 宿主细胞中扩增 2)核酸探针种类 i.DNA探针:分离自某一种生物 i寡核苷酸探针:根据目的基因编码蛋白质的部分氨基 酸序列推测
2．核酸杂交法 1)原理 利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交 的特点分离目的基因（同源序列不是完全相同序列） 优点：不需要基因表达 必备条件：合适的核酸探针或有关资料，外源DNA能在 宿主细胞中扩增 2)核酸探针种类 i. DNA探针: 分离自某一种生物 ii.寡核苷酸探针: 根据目的基因编码蛋白质的部分氨基 酸序列推测