如: Leu-Va1- Phe-His-Asp-Ala六肽 QUN-GUN- UUQ-CAQ-GAQ-GCN对应 mRNA N:ACGT/U CAN-AP- GTP-CTP-CG探针序列Q:CT/UP:AG 32种14聚体混合物,其中必有一种14聚体与待测DNA完全互补 选择的肽段中氨基酸的简并密码子应最少。 这种探针最好用于目的cDNA分离。若用于分离基因,要 事先考虑到此探针序列横跨内含子序列的可能。 此种探针亦可根据其他来源相同基因的保守序入设计。 CDNA探针:利用特异性mRNA反转录而成,亦可用不 同mRNA混合物反转录而成 iV, PCR探针 V.RNA探针:由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游 基因片段而得
如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala 六肽 QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN 对应mRNA N：ACGT/U CAN-AAP-GTP-CTP-CG 探针序列 Q：CT/U P：AG 32种14聚体混合物，其中必有一种14聚体与待测DNA完全互补 * 选择的肽段中氨基酸的简并密码子应最少。 **这种探针最好用于目的cDNA分离。若用于分离基因，要 事先考虑到此探针序列横跨内含子序列的可能。 ***此种探针亦可根据其他来源相同基因的保守序列设计。 iii. cDNA探针: 利用特异性 mRNA反转录而成，亦可用不 同mRNA 混合物反转录而成 iv. PCR探针 v. RNA探针: 由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游 基因片段而得
3)分离步骤 基因(基因组或cDNA文库一制备DNA样品膜与标记探针 杂交一杂交斑点(阳性克隆)一分离重组DNA分子→作斑 点杂交→阳性克隆 Southern杂交以确认杂交结果→DNA 进一步证实和鉴定:核酸序列分析,与蛋白质一级结构比 较;分离插入片段进行基因表达,用免疫方法或其他方法 检测表达产物 3.免疫法 1)原理 外源DNA引人宿主细胞后表达出蛋白质,以此为抗 原与相应的抗体发生免疫反应,然后利用二抗与一抗反应, 用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA
3) 分离步骤 基因(基因组或cDNA)文库→制备DNA样品膜→与标记探针 杂交 →杂交斑点（阳性克隆）→分离重组DNA分子→ 作斑 点杂交→阳性克隆→Southern杂交以确认杂交结果→ DNA 进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比 较；分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法 检测表达产物 3. 免疫法 1) 原理 外源DNA引人宿主细胞后表达出蛋白质，以此为抗 原与相应的抗体发生免疫反应, 然后利用二抗与一抗反应， 用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA
优点:不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决 定序列能被正确表达。 外源DNA可以是一个完整编码区,也可能是一个外显 子,这些序列可以插入Eco表达型载体。 必备条件:待分离基因的表达产物蛋白质必须纯化和用 于制备相应抗体。 2)分离步骤 基因文库蛋白质样品膜制备→免疫法筛选有色斑 点(阳性克隆)一进一步证实:分离阳性克隆无细胞 抽提物,作斑点印迹, western印迹免疫分析;分离重 组DNA,检测插入片段大小,测序等
优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决 定序列能被正确表达。 * 外源DNA可以是一个完整编码区，也可能是一个外显 子，这些序列可以插入E.coli表达型载体。 必备条件：待分离基因的表达产物—蛋白质必须纯化和用 于制备相应抗体。 2) 分离步骤 基因文库→蛋白质样品膜制备→免疫法筛选→有色斑 点（阳性克隆）→进一步证实：分离阳性克隆无细胞 抽提物，作斑点印迹，western印迹免疫分析；分离重 组DNA，检测插入片段大小，测序等
4.染色体巡查法( chromosome walking) 1)原理 利用DNA探针筛选对应重组DNA,然后以插入片段两末 端片段为探针选择对应重组DNA,此次筛选的DNA插入片 段仅以一端为探针,继续和重复该过程,直至筛选到目的基 因 优点:可获得染色体中一段DNA的限制酶图谱,对基因组全序 列测定十分有用 缺点:工作量大,鉴定困难,当巡查高等真核生物染色体时, 重复DNA序列区域难以跨越。 必要条件:两基因间距离应清楚。 该法的两大难点:限制酶图制作和末端片段探针制备。前者 可用改进的载体,后者可用RNA聚合酶合成末端探针 2)操作步骤
4. 染色体巡查法(chromosome walking) 1) 原理 利用DNA探针筛选对应重组DNA，然后以插入片段两末 端片段为探针选择对应重组DNA，此次筛选的DNA插入片 段仅以一端为探针，继续和重复该过程，直至筛选到目的基 因 优点：可获得染色体中一段DNA的限制酶图谱，对基因组全序 列测定十分有用 缺点：工作量大，鉴定困难，当巡查高等真核生物染色体时， 重复DNA序列区域难以跨越。 必要条件：两基因间距离应清楚。 * 该法的两大难点：限制酶图制作和末端片段探针制备。前者 可用改进的载体，后者可用RNA聚合酶合成末端探针 2) 操作步骤
染色体巡查示意图 RE RE 3 第一次巡查 以G基因上下游片段为探针 第二次巡查 n次巡查
RE RE G 5' 3' 3' 5' 第一次巡查 以G基因上下游片段为探针 第二次巡查 G1 n次巡查 G2 G1 G G2 染色体巡查示意图