上海中医药大学《实验中医学》教案(7) 课程名称实验中医学(理论部分)总学时数36 专业中医基础和中医临床专业授课教师方肇勤 内容实验中医学常用的实验研究方法及其在中医研时16 究中的应用 本次 掌握不同学科实验研究方法的特点和优势 课目2.掌握如何根据实验研究的要求选择实验研究方法(包括一种或几种 的要 方法)。 求3.了解各学科的主要实验研究方法 4.了解各学科实验研究方法在中医药研究中的应用。 5.了解了解各学科研究中医药学的现状。 本次「第一节解剖学方法及其在中医研究中的应用 课的1.大体解剖学的主要方法 重点|2.大体解剖学方法研究中医的现状。 难点第二节组织学方法及其在中医研究中的应用 组织学的主要研究方法 2.组织学方法研究中医的现状。 第三节电镜技术及其在中医研究中的应用 1.电子显微镜及电子显微术概况。 2.电子显微术研究中医的现状 第四节生物化学方法及其在中医研究中的应用 1.生物化学的主要方法 2.生物化学方法研究中医的现状。 第五节生理学方法及其在中医研究中的应用 生理学的主要方法 2.生理学方法研究中医的现状 第六节免疫学方法及其在中医研究中的应用 1.免疫学的主要方法。 2.用免疫学方法研究中医的现状 第七节核医学方法及其在中医研究中的应用 1.核医学的主要研究方法。 2.用核医学方法研究中医的现状。 第八节分子生物学方法及其在中医研究中的应用 1.分子生物学的主要技术和方法。 2.用分子生物学方法研究中医的现状。 本次 课的多媒体设备。 应用 教具
上海中医药大学《实验中医学》教案（7） 课程名称 实验中医学（理论部分） 总学时数 36 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤 内容 实验中医学常用的实验研究方法及其在中医研 究中的应用 时 数 16 本次 课目 的要 求 1．掌握不同学科实验研究方法的特点和优势。 2．掌握如何根据实验研究的要求选择实验研究方法（包括一种或几种 方法）。 3．了解各学科的主要实验研究方法。 4．了解各学科实验研究方法在中医药研究中的应用。 5．了解了解各学科研究中医药学的现状。 本次 课的 重点 难点 第一节 解剖学方法及其在中医研究中的应用 1．大体解剖学的主要方法。 2．大体解剖学方法研究中医的现状。 第二节 组织学方法及其在中医研究中的应用 1．组织学的主要研究方法。 2．组织学方法研究中医的现状。 第三节 电镜技术及其在中医研究中的应用 1．电子显微镜及电子显微术概况。 2．电子显微术研究中医的现状。 第四节 生物化学方法及其在中医研究中的应用 1．生物化学的主要方法。 2．生物化学方法研究中医的现状。 第五节 生理学方法及其在中医研究中的应用 1．生理学的主要方法。 2．生理学方法研究中医的现状。 第六节 免疫学方法及其在中医研究中的应用 1．免疫学的主要方法。 2．用免疫学方法研究中医的现状。 第七节 核医学方法及其在中医研究中的应用 1．核医学的主要研究方法。 2．用核医学方法研究中医的现状。 第八节 分子生物学方法及其在中医研究中的应用 1．分子生物学的主要技术和方法。 2．用分子生物学方法研究中医的现状。 本次 课的 应用 教具 多媒体设备
第二节组织学方法及其 在中医研究中的应用 (2学时) 首先,对上一节课布置的作业进行课堂提问。课堂讨论,结论:不同血府 许多初涉中医实验研究的人,最大的问题是不知道如何着手研究,不知道观察什么指 比如,发现某张中药复方治疗肿瘤,比如肝癌,有效,想研究证明其疗效,分析其作 用机理。怎么办。 你们说怎么办?如何入手?说说看实现的路线、步骤 在实验研究中可以观察许多方面,看看中药治疗后在哪些方面起作用。其中形态学是 最常用的观察手段。即使在分子生物学迅速发展的今天,也是如此。有许多优点,实在 形态学方法大体有3个层次:大体解剖、光镜、电镜。 大体解剖:肉眼所见,最为基本。如果肿瘤体积在用了中药后,没有减小,再什么先 进的研究也没有必要。临床所见也大体如此,比如咳嗽好了没有,骨头接上了没有。这些最 基本。 光镜:但是, 电镜 建立以实验科学为前导的基础理论研究,是发展中医学的重要一环,建立动物模型可 以在脏象学说的基础上开展实验研究,使中医学理论建立在可观性的结构基础上(如应用形 态学研究中医理论)。从进化论观点,人与动物结构与功能有共同点,动物模型可使中医理 论研究涉及多学科、多层次的形态学等方面,并以一系列的指标进行研究,使中医理论具有 可验证性。如“肾虚”证无法得到人体脏器的结构资料,通过建立“肾虚模型”可在处死的 动物上获得全身组织器官的组织学、组织化学与超微结构等变化的系统资料。 总之,选择中西医共同结合点一一建立中医证、病动物模型+中药反证(实验性治疗) 观察机体的细胞、组织与器官的组织学、组织化学与超微结构的变化一一积累、总结大 量的科研资料,可以阐明中医理论的物质基础与规律性,应用于临床研究,可加速中医的发 展,使之逐步现代化。因此有非常重要的理论意义和实践意义。 6.2.1组织学的主要研究方法 组织学是研究机体微细结构及其相关功能的科学。组织大致可分为两大部分,即基本 组织和器官系统。机体是由细胞和细胞间质组成,细胞是组成机体的基本结构和功能单位 众多细胞由细胞间质粘合在一起,构成一个细胞群体,称为组织。几种组织相互有机结合组 成器官与系统。 组织学是应用多种实验技术和染色方法以及各种显微镜对机体细胞、组织和器官的微 细结构及其功能之间的关系进行深入的研究。近年随着科学技术的发展,特别是激光光学 流体喷射技术、电子学和计算机技术的发展,组织学研究方法在经典技术的基础上取得了巨 大进展,不仅对细胞的形态结构及其与功能之间的关系的观察更为精细和深入,而且对细胞 在功能活动中的各种酶活性和各种物质的含量变化,亦可进行精确的定位和定量。由于分子 生物学,特别是核酸的原位杂交技术的改进和建立,对细胞遗传学、基因工程和在细胞分化 过程中基因结构的重组,以及癌基因的定位研究取得了突破性进展 组织学研究方法很多,并随着科学技术的发展,又不断地引用或创建新的技术,但 是,无论何种研究方法,都需要应用各型显微镜观察。在应用中要根据研究目的和内容,选 择相应的技术方法才能获得预期的效果。这里仅就最常用和最基本的一些方法作简单介绍 (电镜方法详见有关章节)
第二节 组织学方法及其 在中医研究中的应用 （2 学时） 首先，对上一节课布置的作业进行课堂提问。课堂讨论，结论：不同血府 许多初涉中医实验研究的人，最大的问题是不知道如何着手研究，不知道观察什么指 标。 比如，发现某张中药复方治疗肿瘤，比如肝癌，有效，想研究证明其疗效，分析其作 用机理。怎么办。 你们说怎么办？如何入手？说说看实现的路线、步骤。 在实验研究中可以观察许多方面，看看中药治疗后在哪些方面起作用。其中形态学是 最常用的观察手段。即使在分子生物学迅速发展的今天，也是如此。有许多优点，实在。 形态学方法大体有 3 个层次：大体解剖、光镜、电镜。 大体解剖：肉眼所见，最为基本。如果肿瘤体积在用了中药后，没有减小，再什么先 进的研究也没有必要。临床所见也大体如此，比如咳嗽好了没有，骨头接上了没有。这些最 基本。 光镜：但是， 电镜 建立以实验科学为前导的基础理论研究，是发展中医学的重要一环，建立动物模型可 以在脏象学说的基础上开展实验研究，使中医学理论建立在可观性的结构基础上（如应用形 态学研究中医理论）。从进化论观点，人与动物结构与功能有共同点，动物模型可使中医理 论研究涉及多学科、多层次的形态学等方面，并以一系列的指标进行研究，使中医理论具有 可验证性。如“肾虚”证无法得到人体脏器的结构资料，通过建立“肾虚模型”可在处死的 动物上获得全身组织器官的组织学、组织化学与超微结构等变化的系统资料。 总之，选择中西医共同结合点——建立中医证、病动物模型+中药反证（实验性治疗） ——观察机体的细胞、组织与器官的组织学、组织化学与超微结构的变化——积累、总结大 量的科研资料，可以阐明中医理论的物质基础与规律性，应用于临床研究，可加速中医的发 展，使之逐步现代化。因此有非常重要的理论意义和实践意义。 6．2．1 组织学的主要研究方法 组织学是研究机体微细结构及其相关功能的科学。组织大致可分为两大部分，即基本 组织和器官系统。机体是由细胞和细胞间质组成，细胞是组成机体的基本结构和功能单位， 众多细胞由细胞间质粘合在一起，构成一个细胞群体，称为组织。几种组织相互有机结合组 成器官与系统。 组织学是应用多种实验技术和染色方法以及各种显微镜对机体细胞、组织和器官的微 细结构及其功能之间的关系进行深入的研究。近年随着科学技术的发展，特别是激光光学、 流体喷射技术、电子学和计算机技术的发展，组织学研究方法在经典技术的基础上取得了巨 大进展，不仅对细胞的形态结构及其与功能之间的关系的观察更为精细和深入，而且对细胞 在功能活动中的各种酶活性和各种物质的含量变化，亦可进行精确的定位和定量。由于分子 生物学，特别是核酸的原位杂交技术的改进和建立，对细胞遗传学、基因工程和在细胞分化 过程中基因结构的重组，以及癌基因的定位研究取得了突破性进展。 组织学研究方法很多，并随着科学技术的发展，又不断地引用或创建新的技术，但 是，无论何种研究方法，都需要应用各型显微镜观察。在应用中要根据研究目的和内容，选 择相应的技术方法才能获得预期的效果。这里仅就最常用和最基本的一些方法作简单介绍 （电镜方法详见有关章节）
6.2.1.1常用光镜标本制备技术 切片标本的制备。这是最常用的方法。应用光学显微镜观察机体各部的微细结构时, 首先应把所有要观察的材料制成薄片,最基本的就是切片方法,其中石蜡切片更为常用。其 制备程序大致如下 1.取材与固定。将所要观察的人体或动物的新鲜材料切成适当的小块,立即浸入固定 液(如甲醛溶液等)中进行固定,防止离体后结构发生变化,使其尽可能保持活体时的结构 状态。 2.脱水与包埋。为了使石蜡能浸入组织内,把固定好的材料用乙醇等脱水,经二甲苯 透明后,再浸入加温溶化的石蜡中浸透包埋使组织块变硬 3.切片与染色。将包埋的组织蜡块,用切片机切成5-10μm左右的薄片,贴在载玻片 上,脱蜡后进行染色。最常用的染色法是苏木精和伊红染色,简称HE染色 4.封固。在切片上滴加中性树胶,用盖玻片进行封固,保存备用。 在制作较硬组织(如骨组织等)或较大组织器官(如眼球)等切片,可用火棉胶代替 石蜡进行浸透包埋,再进行染色。为了较好地保存细胞内酶的活性,可选用冰冻切片,将 组织在低温条件下快速冻结,直接切片,进行染色。 6.2.1.2涂片、铺片、磨片标本的制备 血液等液体材料,可直接在玻片上涂片,干燥后再进行固定和染色。疏松结缔组织和 肠系膜等薄层组织,可在玻片撕开展平,制成铺片,待干燥后进行固定和染色。骨和牙等坚 硬组织除用酸(稀硝酸等)脱钙后再按常规制成切片外,还可直接硏磨成薄的磨片进行染色 观察 6.2.1.3组织化学和免疫组织化学方法 组织化学与细胞化学是应用物理、化学和免疫学方法,对组织、细胞内某些化学成分 的定性、定位和定量进行研究,从而探讨与其相关的机能活动 1.组织化学。其原理是在组织切片上或被取材料上,加某种试剂,使它与组织或细胞 内某些物质起化学反应,形成最终反应产物。光镜组织化学要求其最终产物是有色的沉着 物:电镜细胞化学要求其最终产物是重金属沉着物。观察其沉着物的颜色、深浅或电子密 度,可对某种物质进行定性、定位和定量。 2.免疫细胞化学。是将免疫学基本理论与细胞化学技术相结合而建立起来的新技术 主要是应用抗原与抗体特异性结合的特点,检测细胞内某些肽类和蛋白质等大分子物质的分 布。肽类和蛋白质种类繁多,均具抗原性。提取动物的某些肽类和蛋白质,作为抗原注入另 种动物体内,则产生与抗原相应的特异性抗体(免疫球蛋白),从血清中制备该抗体。如 使抗体与荧光素结合,则形成荧光标记抗体。常用的荧光素为异硫氰酸荧光素(FITC) 当用该荧光素标记抗体处理组织切片时,则与组织内相应抗原发生特异结合,在荧光显微镜 下呈黄绿色荧光部分,即为抗原抗体复合物,称此为荧光标记抗体法。如抗体与辣根过氧化 物酶(HRP)等酶标记,与抗原结合后呈棕红色,可在光镜或电镜下观察,此即酶标抗体 6.2.1.4组织培养 组织培养或细胞培养是在体外研究活组织或活细胞的形态结构和生理功能动态变化的 种很有价值的研究手段,已广泛应用于生物医学的各个领域。组织培养是在无菌条件下进 行,从机体取得的活组织或活细胞,或者长期传代培养的细胞株,放入盛有营养液的培养基 (天然的或人工合成的)的培养瓶(板)内保持一定温度、适宜的O2与CO2浓度、pH值等 条件进行培养。可在倒置显微镜下直接观察细胞的增殖、分化、运动、吞噬等动态变化,并 可用显微录像或显微电影真实地记录下活细胞的连续变化过程 6.2.1.5放射自显影 放射自显影是研究追踪某些物质在体内或细胞内的代谢径路与结构的关系。 将放射性同位素或同位素标记的物质注入体内或组织培养的营养液内,间隔一定时间 取出被检材料,制成标本切片或整体切片,并在其上涂以感光材料,置暗处曝光,继数日或 数周后,再经显影、定影处理,在放射性同位素或标记物存在的部位,溴化银被还原成微 细的银粒。这样可在光镜或电镜下观察结构的同时,观察放射性同位素或其标记物的分布 数量、排泄等代谢过程,借此可判明该物质的动态变化过程及其与功能的关系
6．2．1．1 常用光镜标本制备技术 切片标本的制备。这是最常用的方法。应用光学显微镜观察机体各部的微细结构时， 首先应把所有要观察的材料制成薄片，最基本的就是切片方法，其中石蜡切片更为常用。其 制备程序大致如下： 1．取材与固定。将所要观察的人体或动物的新鲜材料切成适当的小块，立即浸入固定 液（如甲醛溶液等）中进行固定，防止离体后结构发生变化，使其尽可能保持活体时的结构 状态。 2．脱水与包埋。为了使石蜡能浸入组织内，把固定好的材料用乙醇等脱水，经二甲苯 透明后，再浸入加温溶化的石蜡中浸透包埋使组织块变硬。 3．切片与染色。将包埋的组织蜡块，用切片机切成 5-10μm 左右的薄片，贴在载玻片 上，脱蜡后进行染色。最常用的染色法是苏木精和伊红染色，简称 HE 染色。 4．封固。在切片上滴加中性树胶，用盖玻片进行封固，保存备用。 在制作较硬组织（如骨组织等）或较大组织器官（如眼球）等切片，可用火棉胶代替 石蜡进行浸透包埋，再进行染色。为了较好地保存细胞内酶的活性 ，可选用冰冻切片，将 组织在低温条件下快速冻结，直接切片，进行染色。 6．2．1．2 涂片、铺片、磨片标本的制备 血液等液体材料，可直接在玻片上涂片，干燥后再进行固定和染色。疏松结缔组织和 肠系膜等薄层组织，可在玻片撕开展平，制成铺片，待干燥后进行固定和染色。骨和牙等坚 硬组织除用酸（稀硝酸等）脱钙后再按常规制成切片外，还可直接研磨成薄的磨片进行染色 观察。 6．2．1．3 组织化学和免疫组织化学方法 组织化学与细胞化学是应用物理、化学和免疫学方法，对组织、细胞内某些化学成分 的定性、定位和定量进行研究，从而探讨与其相关的机能活动。 1．组织化学。其原理是在组织切片上或被取材料上，加某种试剂，使它与组织或细胞 内某些物质起化学反应，形成最终反应产物。光镜组织化学要求其最终产物是有色的沉着 物；电镜细胞化学要求其最终产物是重金属沉着物。观察其沉着物的颜色、深浅或电子密 度，可对某种物质进行定性、定位和定量。 2．免疫细胞化学。是将免疫学基本理论与细胞化学技术相结合而建立起来的新技术。 主要是应用抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某些肽类和蛋白质等大分子物质的分 布。肽类和蛋白质种类繁多，均具抗原性。提取动物的某些肽类和蛋白质，作为抗原注入另 一种动物体内，则产生与抗原相应的特异性抗体（免疫球蛋白），从血清中制备该抗体。如 使抗体与荧光素结合，则形成荧光标记抗体。常用的荧光素为异硫氰酸荧光素（FITC）， 当用该荧光素标记抗体处理组织切片时，则与组织内相应抗原发生特异结合，在荧光显微镜 下呈黄绿色荧光部分，即为抗原抗体复合物，称此为荧光标记抗体法。如抗体与辣根过氧化 物酶（HRP）等酶标记，与抗原结合后呈棕红色，可在光镜或电镜下观察，此即酶标抗体 法。 6．2．1．4 组织培养 组织培养或细胞培养是在体外研究活组织或活细胞的形态结构和生理功能动态变化的 一种很有价值的研究手段，已广泛应用于生物医学的各个领域。组织培养是在无菌条件下进 行，从机体取得的活组织或活细胞，或者长期传代培养的细胞株，放入盛有营养液的培养基 （天然的或人工合成的）的培养瓶（板）内保持一定温度、适宜的 O2 与 CO2 浓度、pH 值等 条件进行培养。可在倒置显微镜下直接观察细胞的增殖、分化、运动、吞噬等动态变化，并 可用显微录像或显微电影真实地记录下活细胞的连续变化过程。 6．2．1．5 放射自显影 放射自显影是研究追踪某些物质在体内或细胞内的代谢径路与结构的关系。 将放射性同位素或同位素标记的物质注入体内或组织培养的营养液内，间隔一定时间 取出被检材料，制成标本切片或整体切片，并在其上涂以感光材料，置暗处曝光，继数日或 数周后，再经显影、定影处理，在放射性同位素或标记物存在的部位，溴 化银被还原成微 细的银粒。这样可在光镜或电镜下观察结构的同时，观察放射性同位素或其标记物的分布、 数量、排泄等代谢过程，借此可判明该物质的动态变化过程及其与功能的关系
在生物医学研究中,常用放射同位素主要是能量低、射程短、电离作用强的β射线 有3H、1C、3P、5S、121、4Ca等及其化合物。如将11注入体内,观察碘在甲状腺内的 代谢情况 6.2.1.6形态计量 形态计量或立体计量术是研究组织和细胞内各种有形成份的数量、体积、表面积等绝 对和相对数值的方法。研究物体某些结构的立体数值的科学,称体视学。光镜结构的计量硏 究已积累了许多有意义的资料。近年来开始研究细胞超微结构的计量,如肝细胞中各种细胞 器的数量、大小、体积、表面积等。这些数值以“量”的概念阐述了结构与功能的关系及病 理状态下发生的变化。通过组织切片或照片的平面图象的测定,可将平面的测量数据按数学 原理和公式推算出立体结构参数。目前常用的精密定量仪器有 1.显微分光光度术。是显微镜技术和分光光度技术两者的结合,是定量的显微镜技 术,可测出细胞内各种化学成分的含量。如测定DNA、RNA、酶、脂类和糖类的含量 2.显微萤光光度术。是利用细胞内原有发生萤光的物质,或对细胞内各种化学成分用 不同萤光素标记后,进行定性、定位和定量的测量 3.流式细胞光度术。是一种对流体单个细胞及其它生物微粒进行快速定量分析及分选 技术。同时可测量一个细胞的8个相关参数,测量速度可达5000个细胞秒,分选纯度可高 达99%以上。可获得细胞的大小、形态、细胞内颗粒的多少:经荧光染色可测量DNA RNA、蛋白质、细胞膜上的受体和抗原等。 4.图象分析仪。又称图象分析系统,它是当代形态计量的最精密、最现代化的仪器之 。它是在计算机、显示器和数字图象处理等综合起来的一种新技术。经测定可获得组织和 细胞内各种有形成分(包括切片、照片、Ⅹ光片和实物等)的数量、长度、面积、体积或将 二维结构转换成三维立体结构及各种物质染色后的灰度等项目的相对数值,对组织化学的有 色反应产物和放射自显影的银颗粒等方面均可进行定位和定量。该仪器使用广泛,所得数据 可经计算机进行统计学处理,迅速得出分析结果 上述各种测试仪器已成为组织化学、细胞化学、病理学、免疫学和药物学以及其他生 物医学各学科的重要研究工具 6.2.1.7显微镜 1.普通光学显微镜。光镜的机械部分由镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器和调 焦螺旋等组成:光学部分包括目镜、物镜、聚光器和反光镜。目镜有放大5倍、8倍、10 倍、15倍几种。物镜一般有10倍、20倍、40倍和100倍(油浸镜)几种。光镜的放大率等 于物镜和目镜放大倍数的乘积 暗视野显微镜。用于观察在亮视野下因反差太小或分辨率不足的微细结构或颗粒 这种显微镜主要是由一个特殊的暗视野集光器,使光线不直接进入物镜,故呈暗视野。用来 观察不染色的新鲜细胞涂片或放射自显影标本中的银颗粒分布等 3.相差显微镜。主要用于观察组织培养中的活细胞,这种不染色标本,其反差小,在 般光镜下,其结构分不清楚。相差显微镜将细胞各种结构对光线所产生的不同折射作用, 转换成光密度差异,使镜下结构反差明显,影像淸楚。如将这种显微镜改装成目镜在下,光 源在上,则称为倒置相差显微镜。用以观察贴附于培养瓶的活细胞,效果更好。 4.荧光显微镜。用以观察有自发荧光或经荧光素染色或标记的细胞和组织。这种显微 镜一般是以高压汞灯产生的短波紫外线为光源,荧光物质在紫外线照射下激发出各种颜色的 荧光,借此硏究该荧光物质的分布,该显微镜附有激发、吸热、阻断等滤片系统 6.2.2组织学方法研究中医的现状和范例 1975年,上海中医药大学组织胚胎学教研室施玉华等在国内率先应用组织学方法研究 中医基础理论。二十多年来比较系统地研究“肾”的有关理论、中医药延缓衰老的机制和 十四节气对肾精的影响。在应用组织学研究中医基础理论方面有一定的代表性,现就其研究 思路、方法、结论和体会简介如下: 脏象学说在中医学理论体系中占有极其重要的地位,其形成虽有一定古代解剖学知识 为基础,但其发展主要是基于“有诸内,必形诸外”的观察研究方法,因而其观察分析的结 果必然大大地超越了人体解剖学的脏腑范围,形成了独特的生理和病理的理论体系。因此脏 象学说中的心、肺、脾、肝、肾等脏腑名称,虽与现代解剖学的脏腑名称相同,但在生理、 病理的含义不尽相同。中医脏象学说中一个脏器的生理功能可能包含现代解剖学中几个脏器
在生物医学研究中，常用放射同位素主要是能量低、射程短、电离作用强的β射线， 有 3H、14C、32P、35S、125I、45Ca 等及其化合物。如将 125I 注入体内，观察碘在甲状腺内的 代谢情况。 6．2．1．6 形态计量 形态计量或立体计量术是研究组织和细胞内各种有形成份的数量、体积、表面积等绝 对和相对数值的方法。研究物体某些结构的立体数值的科学，称体视学。光镜结构的计量研 究已积累了许多有意义的资料。近年来开始研究细胞超微结构的计量，如肝细胞中各种细胞 器的数量、大小、体积、表面积等。这些数值以“量”的概念阐述了结构与功能的关系及病 理状态下发生的变化。通过组织切片或照片的平面图象的测定，可将平面的测量数据按数学 原理和公式推算出立体结构参数。目前常用的精密定量仪器有： 1．显微分光光度术。是显微镜技术和分光光度技术两者的结合，是定量的显微镜技 术，可测出细胞内各种化学成分的含量。如测定 DNA、RNA、酶、脂类和糖类的含量。 2．显微萤光光度术。是利用细胞内原有发生萤光的物质，或对细胞内各种化学成分用 不同萤光素标记后，进行定性、定位和定量的测量。 3．流式细胞光度术。是一种对流体单个细胞及其它生物微粒进行快速定量分析及分选 技术。同时可测量一个细胞的 8 个相关参数，测量速度可达 5000 个细胞/秒，分选纯度可高 达 99%以上。可获得细胞的大小、形态、细胞内颗粒的多少；经荧光染色可测量 DNA、 RNA、蛋白质、细胞膜上的受体和抗原等。 4．图象分析仪。又称图象分析系统，它是当代形态计量的最精密、最现代化的仪器之 一。它是在计算机、显示器和数字图象处理等综合起来的一种新技术。经测定可获得组织和 细胞内各种有形成分（包括切片、照片、X 光片和实物等）的数量、长度、面积、体积或将 二维结构转换成三维立体结构及各种物质染色后的灰度等项目的相对数值，对组织化学的有 色反应产物和放射自显影的银颗粒等方面均可进行定位和定量。该仪器使用广泛，所得数据 可经计算机进行统计学处理，迅速得出分析结果。 上述各种测试仪器已成为组织化学、细胞化学、病理学、免疫学和药物学以及其他生 物医学各学科的重要研究工具。 6．2．1．7 显微镜 1．普通光学显微镜。光镜的机械部分由镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器和调 焦螺旋等组成；光学部分包括目镜、物镜、聚光器和反光镜。目镜有放大 5 倍、8 倍、10 倍、15 倍几种。物镜一般有 10 倍、20 倍、40 倍和 100 倍（油浸镜）几种。光镜的放大率等 于物镜和目镜放大倍数的乘积。 2．暗视野显微镜。用于观察在亮视野下因反差太小或分辨率不足的微细结构或颗粒。 这种显微镜主要是由一个特殊的暗视野集光器，使光线不直接进入物镜，故呈暗视野。用来 观察不染色的新鲜细胞涂片或放射自显影标本中的银颗粒分布等。 3．相差显微镜。主要用于观察组织培养中的活细胞，这种不染色标本，其反差小，在 一般光镜下，其结构分不清楚。相差显微镜将细胞各种结构对光线所产生的不同折射作用， 转换成光密度差异，使镜下结构反差明显，影像清楚。如将这种显微镜改装成目镜在下，光 源在上，则称为倒置相差显微镜。用以观察贴附于培养瓶的活细胞，效果更好。 4．荧光显微镜。用以观察有自发荧光或经荧光素染色或标记的细胞和组织。这种显微 镜一般是以高压汞灯产生的短波紫外线为光源，荧光物质在紫外线照射下激发出各种颜色的 荧光，借此研究该荧光物质的分布，该显微镜附有激发、吸热、阻断等滤片系统。 6．2．2 组织学方法研究中医的现状和范例 1975 年，上海中医药大学组织胚胎学教研室施玉华等在国内率先应用组织学方法研究 中医基础理论。二十多年来比较系统地研究“肾”的有关理论、中医药延缓衰老的机制和二 十四节气对肾精的影响。在应用组织学研究中医基础理论方面有一定的代表性，现就其研究 思路、方法、结论和体会简介如下： 脏象学说在中医学理论体系中占有极其重要的地位，其形成虽有一定古代解剖学知识 为基础，但其发展主要是基于“有诸内，必形诸外”的观察研究方法，因而其观察分析的结 果必然大大地超越了人体解剖学的脏腑范围，形成了独特的生理和病理的理论体系。因此脏 象学说中的心、肺、脾、肝、肾等脏腑名称，虽与现代解剖学的脏腑名称相同，但在生理、 病理的含义不尽相同。中医脏象学说中一个脏器的生理功能可能包含现代解剖学中几个脏器
的生理功能,而现代解剖生理学中一个脏器的生理功能又会分散在藏象学说的几个脏腑的生 理功能之中。肾的情况便是如此。 6.2.2.1肾的研究 肾”的学说是中医基础理论的重要内容。“肾为先天之本”,“肾主藏精之府” “肾主生长”,“肾主生殖”,“肾主骨生髓”与“肾主水液”。历代中医经典著作均给予 了高度重视。 1.“肾主生长”的研究 中医理论认为肾所藏的精气是构成人体的基本物质,也是人体生长发育及各种功能活 动的物质基础,能促进机体的生长、发育和逐步具备生殖能力。现代医学认为除遗传、疾 病、营养与环境影响机体的生长发育外,至少有四种激素关系到机体的生长发育:生长激 素、甲状腺素、雌激素以及来自睾丸与肾上腺的雄激素。这些激素刺激蛋白质与核酸的合成 代谢和骨组织所需的氮、钾、磷和钙等的潴留,加速机体的生长发育。实验以它巴唑与谷氨 酸钠分别建立甲状腺杋能减退幼鼠、大鼠模型与垂体功能低下的肾虚模型,以经典温肾益精 中药(主要为龟龄集与右归丸等)进行实验性治疗,作为药物反证。研究垂体、甲状腺、肝 与长骨等的组织学、组织化学与超微结构的变化。 1)观察温肾益精中药对甲减大鼠模型的肝、甲状腺及垂体等的组织学、组织化学和超 微结构等的影响。甲减大鼠出现类似临床甲减症状,体温、氧耗明显下降。光镜与电镜观 察,肝细胞肿胀透亮,嗜碱性物质减少:滑面内质网(SER)增生:粗面内质网(RER)扩 张、脱颗粒:RNA含量减少:与细胞吸收核苷密切有关的5核苷酸酶(5∵-Nase)活性降 低:葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PDH)活性也降低。以上变化可引起合成核酸的原料不足 造成核酸合成障碍,进而使蛋白质合成障碍,影响细胞的生长发育与代谢过程。肝细胞细胞 色素氧化酶(CCO)降低,说明肝细胞氧化供能过程发生障碍:琥珀酸脱氢酶(SDH)活 性代偿性增加。 温肾益精药使甲减大鼠活动増加,体温与氧耗量提高,肝细胞变性范围较少,程度减 轻;RER排列整齐,数量增多,SER增生减少:使减少的RNA含量增多,5'Nase G6PDH、CCO和SDH活性趋向正常,提示温肾益精中药能够调节甲减大鼠肝细胞的核酸代 谢,促进RNA合成,保护细胞RER及蛋白质的合成过程,有助于细胞的分裂、生长与发 育,并可能通过增加细胞色素C含量,改善呼吸链及氧化磷酸化过程,抑制无氧酵解,更 有效地产生能量,使肝脏以至机体氧耗增加 甲减大鼠甲状腺的结构与功能明显受到伤害,滤泡极度増生,滤泡腔缩小,滤泡细胞 呈高柱状,微绒毛增多增高,RER扩张,甚至融合成大囊泡,线粒体增多,间质毛细血管 扩张,胶质过碘酸雪夫反应(PAS反应)减弱,滤泡上皮葡萄糖-6-磷酸酶(G6P) G6PDH酶活性下降,过氧化物酶(TPO)、SDH、5ˆ-Nase、硫胺素焦磷酸酶(TPP)等酶 活性明显上升。血总甲状腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)水平明显下降。由于它巴唑抑 制了大鼠甲状腺滤泡细胞的葡萄糖氧化,使G6P、G6PDH活性降低,而SDH活性明显上 升;它巴唑还抑制了酪氨酸残基的碘化,两者必然使得甲状腺素的合成与释放障碍,血清 T3、T4水平降低,而垂体促甲状腺素(TSH)反馈性地大量释放,使TPO(参与碘的活化 及酪氨酸残基碘化过程)与TPP(高尔基复合体的标志酶)及SDH活性增强,但是甲状腺 激素的合成过程依然受到影响。 甲减大鼠垂体前叶很少见到正常形态的TSH细胞,其RER扩张,转变成去甲状腺细 胞:多种细胞线粒体髓鞘样变;血清TSH水平明显上升。表明甲减垂体前叶结构,由于甲 状腺功能受到抑制而遭到严重损害。甲减大鼠垂体后叶分泌物明显减少,染色反应减弱。 温肾益精药组大鼠甲状腺仍増生,但部分滤泡细胞接近正常,其G6P、G6PDH SDH、TPO等酶活性趋向正常,血清总T4、T3水平上升,垂体TSH、STH细胞增加,去甲 状腺细胞明显减少,血清TSH水平下降。垂体后叶激素含量趋向正常。提示温肾益精药能 改善甲减大鼠肝、甲状腺、垂体的形态学变化,保护垂体的结构,且能调节下丘脑旁室核与 视上核的分泌作用。 2)观察温肾益精中药对甲减幼大鼠长骨、肝、甲状腺和垂体等的组织学、组织化学和 超微结构的影响。甲减幼大鼠,其长骨重量减轻,骨小梁细,骺板无机焦磷酸酶反应显著降 低,含无机焦磷酸酶和碱性磷酸酶(AKP)及PAS反应的骺板软骨细胞层数显著减减少, 血Ca、P、Na显著下降。龟龄集使长骨重量増加,骺板无机焦磷酸酶活性显著上升,含无
的生理功能，而现代解剖生理学中一个脏器的生理功能又会分散在藏象学说的几个脏腑的生 理功能之中。肾的情况便是如此。 6．2．2．1 肾的研究 “肾”的学说是中医基础理论的重要内容。“肾为先天之本”，“肾主藏精之府”， “肾主生长”，“肾主生殖”，“肾主骨生髓”与“肾主水液”。历代中医经典著作均给予 了高度重视。 1．“肾主生长”的研究 中医理论认为肾所藏的精气是构成人体的基本物质，也是人体生长发育及各种功能活 动的物质基础，能促进机体的生长、发育和逐步具备生殖能力。现代医学认为除遗传、疾 病、营养与环境影响机体的生长发育外，至少有四种激素关系到机体的生长发育：生长激 素、甲状腺素、雌激素以及来自睾丸与肾上腺的雄激素。这些激素刺激蛋白质与核酸的合成 代谢和骨组织所需的氮、钾、磷和钙等的潴留，加速机体的生长发育。实验以它巴唑与谷氨 酸钠分别建立甲状腺机能减退幼鼠、大鼠模型与垂体功能低下的肾虚模型，以经典温肾益精 中药（主要为龟龄集与右归丸等）进行实验性治疗，作为药物反证。研究垂体、甲状腺、肝 与长骨等的组织学、组织化学与超微结构的变化。 1）观察温肾益精中药对甲减大鼠模型的肝、甲状腺及垂体等的组织学、组织化学和超 微结构等的影响。甲减大鼠出现类似临床甲减症状，体温、氧耗明显下降。光镜与电镜观 察，肝细胞肿胀透亮，嗜碱性物质减少；滑面内质网（SER）增生；粗面内质网（RER）扩 张、脱颗粒；RNA 含量减少；与细胞吸收核苷密切有关的 5 核苷酸酶（5’-Nase）活性降 低；葡萄糖六磷酸脱氢酶（G6PDH）活性也降低。以上变化可引起合成核酸的原料不足， 造成核酸合成障碍，进而使蛋白质合成障碍，影响细胞的生长发育与代谢过程。肝细胞细胞 色素氧化酶（CCO）降低，说明肝细胞氧化供能过程发生障碍；琥珀酸脱氢酶（SDH）活 性代偿性增加。 温肾益精药使甲减大鼠活动增加，体温与氧耗量提高，肝细胞变性范围较少，程度减 轻；RER 排列整齐，数量增多，SER 增生减少；使减少的 RNA 含量增多，5’Nase、 G6PDH、CCO 和 SDH 活性趋向正常，提示温肾益精中药能够调节甲减大鼠肝细胞的核酸代 谢，促进 RNA 合成，保护细胞 RER 及蛋白质的合成过程，有助于细胞的分裂、生长与发 育，并可能通过增加细胞色素 C 含量，改善呼吸链及氧化磷酸化过程，抑制无氧酵解，更 有效地产生能量，使肝脏以至机体氧耗增加。 甲减大鼠甲状腺的结构与功能明显受到伤害，滤泡极度增生，滤泡腔缩小，滤泡细胞 呈高柱状，微绒毛增多增高，RER 扩张，甚至融合成大囊泡，线粒体增多，间质毛细血管 扩张，胶质过碘酸雪夫反应（PAS 反应）减弱，滤泡上皮葡萄糖-6-磷酸酶（G6P）、 G6PDH 酶活性下降，过氧化物酶（TPO）、SDH、5’-Nase、硫胺素焦磷酸酶（TPP）等酶 活性明显上升。血总甲状腺素（T4）、三碘甲腺原氨酸（T3）水平明显下降。由于它巴唑抑 制了大鼠甲状腺滤泡细胞的葡萄糖氧化，使 G6P、G6PDH 活性降低，而 SDH 活性明显上 升；它巴唑还抑制了酪氨酸残基的碘化，两者必然使得甲状腺素的合成与释放障碍，血清 T3、T4 水平降低，而垂体促甲状腺素（TSH）反馈性地大量释放，使 TPO（参与碘的活化 及酪氨酸残基碘化过程）与 TPP（高尔基复合体的标志酶）及 SDH 活性增强，但是甲状腺 激素的合成过程依然受到影响。 甲减大鼠垂体前叶很少见到正常形态的 TSH 细胞，其 RER 扩张，转变成去甲状腺细 胞；多种细胞线粒体髓鞘样变；血清 TSH 水平明显上升。表明甲减垂体前叶结构，由于甲 状腺功能受到抑制而遭到严重损害。甲减大鼠垂体后叶分泌物明显减少，染色反应减弱。 温肾益精药组大鼠甲状腺仍增生，但部分滤泡细胞接近正常，其 G6P、G6PDH、 SDH、TPO 等酶活性趋向正常，血清总 T4、T3 水平上升，垂体 TSH、STH 细胞增加，去甲 状腺细胞明显减少，血清 TSH 水平下降。垂体后叶激素含量趋向正常。提示温肾益精药能 改善甲减大鼠肝、甲状腺、垂体的形态学变化，保护垂体的结构，且能调节下丘脑旁室核与 视上核的分泌作用。 2）观察温肾益精中药对甲减幼大鼠长骨、肝、甲状腺和垂体等的组织学、组织化学和 超微结构的影响。甲减幼大鼠，其长骨重量减轻，骨小梁细，骺板无机焦磷酸酶反应显著降 低，含无机焦磷酸酶和碱性磷酸酶（AKP）及 PAS 反应的骺板软骨细胞层数显著减减少， 血 Ca、P、Na 显著下降。龟龄集使长骨重量增加，骺板无机焦磷酸酶活性显著上升，含无