上海中医药大学 《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案(7) 课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48 专业中医基础和中医临床专业 授课教师方肇勤、管冬元、潘志强 内课程总结,介绍 DDPCR、 RACEPCR、测序、基时4 容因芯片等 本 次了解 DDPCR、 RACEPCR等技术和应用。 目了解DNA样本测序处理、聚冰烯酰胺凝胶灌胶、上样、电泳、电泳后凝胶 的处理、放射自显影和读片技术 求了解基因芯片、 CDNAArray I原理技术和应用。 概要介绍最新分子生物学技术及其在中医药研究中的应用和课程总结。把业 已操作的实验及其意义串起来重复介绍,明确其目的意义。 次 DDPCR、 RACEPCR等关键技术与常见问题 课 的DNA样本测序处理、聚冰烯酰胺凝胶灌胶、上样、电泳、电泳后凝胶处理、 点放射自显影和读片关键技术与常见问题 难 点了解基因芯片、 CDNA Array原理、关键技术与常见问题。 本次课的应用教具 次多媒体教学课件
上海中医药大学 《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（7） 课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤、管冬元、潘志强 内 容 课程总结，介绍 DDPCR、RACEPCR、测序、基 因芯片等 时 数 4 本 次 课 目 的 要 求 了解 DDPCR、RACEPCR 等技术和应用。 了解 DNA 样本测序处理、聚冰烯酰胺凝胶灌胶、上样、电泳、电泳后凝胶 处理、放射自显影和读片技术。 了解基因芯片、cDNA Array 原理技术和应用。 概要介绍最新分子生物学技术及其在中医药研究中的应用和课程总结。把业 已操作的实验及其意义串起来重复介绍，明确其目的意义。 本 次 课 的 重 点 难 点 DDPCR、RACEPCR 等关键技术与常见问题。 DNA 样本测序处理、聚冰烯酰胺凝胶灌胶、上样、电泳、电泳后凝胶处理、 放射自显影和读片关键技术与常见问题。 了解基因芯片、cDNA Array 原理、关键技术与常见问题。 本 次 课 的 应 用 教 具 多媒体教学课件
课程总结和部分新技术介绍 (4学时) 中医药对基因组作用的研究 实验1基因组DNA提取(方法类似于RNA的提取) 实验2 Southern blot(方法类似于 Northern blot) 实验3PCR PCR是 Polymerase chain reaction的缩写,中文译作聚合酶链式反应。其特点是可以在 几小时内方便、快捷地将微量DNA(含由微量RNA反转录成的cDNA)扩增达10倍,得 到ug级的DNA!该技术发明于八十年代中期,到了八十年代末,由于引用了耐热DNA聚 合酶,使这一技术得以蓬勃发展,成为分子生物学中应用最为广泛的技术之一,发挥着日益 重要的作用 由于其方便快捷,在中医药实验研究和临床检测中应用十分广泛。例如观察慢性炎症 的活检组织中一些与肿瘤发生的基因是否存在突变,中医药治疗后防突变的作用如何:;一些 与肿瘤发生、转归、转移、凋亡等基因的表达如何,中医药的调控如何:探针的扩增等等。 原理 采用两段引物,分别与DNA两条链上各一段序列互补,位于模板DNA中拟扩增片段 两条链的3端。加热使模板DNA变性解链,当反应的温度下降时,两引物分别与模板DNA 两条链发生退火,然后两引物在DNA聚合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过量的两段引物 和4种dNTP的反应体中,位于两段引物间的DNA在反复的变性、退火、延伸的循环里, 每一轮扩增的产物再一次充当下一轮扩增的模板,使其产物增加一倍。经过30-40个循环, 目的DNA可由原来的lpg扩增到lugo 1)引物退火与模版DNA结合;2)PCR第一链的延伸;3)再次变性解链后,上下游 引物分别退火结合到原先和扩增了的模版上:4)PCR第二轮的延伸;5)再次变性解链;6) 再次引物与扩增了的模版退火并延伸。 注意事项 PCR的常见问题主要有 没有PCR产物。其主要可能有PCR反应的有关试剂缺乏,循环次数不够,退火温 度太高,引物设计不好,模版不够,模版质量差,变性温度过高或过低,变性时间过长或过 短,链延伸时间过短,Taq酶数量不够或质量不行,Mg过低,dNTP过少,模版C/G过于 丰富,等等 2.PCR产物不纯,见多条条带产物。其主要可能有循环次数太多,退火温度过低, 引物设计不合理,污染等。其中,引物设计不合理的可能性最大 3.PCR产物前后一片,拖带。其主要可能有循环次数太多,退火温度太低,链延伸 时间过长,模版质量差,模版过多,污染,Taq酶数量过多,Mg过多,等等。 还有一些值得注意的问题 4.关于引物 (1)引物的长度。引物的长度要求不一,如模版是单一的载体和单一的插入片段 可以选用较短的插入片段两侧的载体序列作为引物,一些常用载体有现成的引物商品,可以 购买。对于复杂的基因库,或反转录产物,为提高引物的特异性,建议采用较长的引物。具 体可以参见 RACE PCR介绍。 (2)引物的CG与AT的比例。可能的话,建议1:1左右。 (3)引物的计算机设计参见本书 RIPCR介绍 5.关于酶。一些实验反复失败,竟然会与酶的质量问题有关。因此,我们建议购买 那些经常从事PCR实验的实验室所经常使用品牌及其供应商的PCR酶 6.退火温度。通常按照检索到的文献或试剂盒提供的方法,可以确定退火温度。但
课程总结和部分新技术介绍 （4 学时） 一、中医药对基因组作用的研究 实验 1 基因组 DNA 提取（方法类似于 RNA 的提取） 实验 2 Southern blot（方法类似于 Northern blot） 实验 3 PCR PCR 是 Polymerase chain reaction 的缩写，中文译作聚合酶链式反应。其特点是可以在 几小时内方便、快捷地将微量 DNA（含由微量 RNA 反转录成的 cDNA）扩增达 106 倍，得 到 ug 级的 DNA！该技术发明于八十年代中期，到了八十年代末，由于引用了耐热 DNA 聚 合酶，使这一技术得以蓬勃发展，成为分子生物学中应用最为广泛的技术之一，发挥着日益 重要的作用。 由于其方便快捷，在中医药实验研究和临床检测中应用十分广泛。例如观察慢性炎症 的活检组织中一些与肿瘤发生的基因是否存在突变，中医药治疗后防突变的作用如何；一些 与肿瘤发生、转归、转移、凋亡等基因的表达如何，中医药的调控如何；探针的扩增等等。 原理 采用两段引物，分别与 DNA 两条链上各一段序列互补，位于模板 DNA 中拟扩增片段 两条链的 3'端。加热使模板 DNA 变性解链，当反应的温度下降时，两引物分别与模板 DNA 两条链发生退火，然后两引物在 DNA 聚合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过量的两段引物 和 4 种 dNTP 的反应体中，位于两段引物间的 DNA 在反复的变性、退火、延伸的循环里， 每一轮扩增的产物再一次充当下一轮扩增的模板，使其产物增加一倍。经过 30-40 个循环， 目的 DNA 可由原来的 1pg 扩增到 1ug。 1）引物退火与模版 DNA 结合；2）PCR 第一链的延伸；3）再次变性解链后，上下游 引物分别退火结合到原先和扩增了的模版上；4）PCR 第二轮的延伸；5）再次变性解链；6） 再次引物与扩增了的模版退火并延伸。 注意事项 PCR 的常见问题主要有： 1．没有 PCR 产物。其主要可能有 PCR 反应的有关试剂缺乏，循环次数不够，退火温 度太高，引物设计不好，模版不够，模版质量差，变性温度过高或过低，变性时间过长或过 短，链延伸时间过短，Taq 酶数量不够或质量不行，Mg++过低，dNTP 过少，模版 C/G 过于 丰富，等等。 2．PCR 产物不纯，见多条条带产物。其主要可能有循环次数太多，退火温度过低， 引物设计不合理，污染等。其中，引物设计不合理的可能性最大。 3．PCR 产物前后一片，拖带。其主要可能有循环次数太多，退火温度太低，链延伸 时间过长，模版质量差，模版过多，污染，Taq 酶数量过多，Mg++过多，等等。 还有一些值得注意的问题： 4．关于引物。 （1）引物的长度。引物的长度要求不一，如模版是单一的载体和单一的插入片段， 可以选用较短的插入片段两侧的载体序列作为引物，一些常用载体有现成的引物商品，可以 购买。对于复杂的基因库，或反转录产物，为提高引物的特异性，建议采用较长的引物。具 体可以参见 RACE PCR 介绍。 （2）引物的 CG 与 AT 的比例。可能的话，建议 1:1 左右。 （3）引物的计算机设计参见本书 RTPCR 介绍。 5．关于酶。一些实验反复失败，竟然会与酶的质量问题有关。因此，我们建议购买 那些经常从事 PCR 实验的实验室所经常使用品牌及其供应商的 PCR 酶。 6．退火温度。通常按照检索到的文献或试剂盒提供的方法，可以确定退火温度。但
是,时常会碰到两条引物的Tm值不一致,或PCR反复调整仍不见改善,此时可以考虑 Touch Down Pcr的方法,具体参见本书 RACE PCR介绍。 7.CG丰富的DNA模版往往不容易扩增,对此,可以采用DMSO( DIMETHYL SULFOXIDE),用量为PCR反应总容积的1/10。比如将4u的DMSO加入36u的PCR反 应液,使总容积达40ul 8.MgCl2。通常 PCR buffer中含有MgC2,但是由于一些不清楚的原因,有时仍嫌不 足,此时可以适当增加MgCl2的浓度 9.PCR是一种十分灵敏的实验,对操作技巧要求高,为防止加样误差,建议做复管 同时,同时进行多个反应时,相同的试剂建议先一道配置,并留有余量,比如Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP、消毒过的双蒸水等,混匀,这样可以很大程度上避免上样误差。 10.关于电泳参见本书实验29。 11.关于试管。为提高PCR的质量,以及大批量PCR反应的操作,目前业已开发出 不同的PCR试管。比如为减少管壁导热的延滞,发展出超薄壁的PCR试管:为满足批量实 验,发展出排状PCR试管,等等。我们在实验中先后使用过一些不同的试管,从操作方便 和安全上看仍喜欢采用0.5ml的试管。这样的试管比较结实,不宜引起试管的破裂和同位素 的泄漏,且手持起来方便。 实验4点突变PCR 点突变PCR的使用机会越来越多了起来。当研究发现中医药对某些特定基因的具有调 整作用以后,自然要求深入了解实现对该基因调整的具体途径,比如中医药对某基因的调整 是直接的,并通过这样的调整发挥疗效,抑或是间接的;如果这些基因的功能尚不清楚,那 么,哪些部位是主要的功能区,改变了这些功能区会如何:在这些基因中中医药可能对启动 子的哪些部位发生作用,等等,点突变PCR技术可以为回答这些疑问提供方便。 本方法是利用PCR技术,改变目的基因的个别或若干碱基,使该碱基所处位置的基因 功能发生变化,以观察其意义。例如对于功能基因,可以检测点突变后功能是否发生变化, 以逐步明确功能区的意义;或直接破坏一些已明确的功能区,使该基因失去原有功能:或用 于筛选启动子中的重要序列、增强子的位置,了解一些已知转录调控蛋白及其特定结合序列 的关系,等等。 点突变PCR技术的实现主要有两种方法,一种是比较老的办法,叫做两步法点突变 PCR;另一种发展比较晩,并得益于Taq酶性能的提高,称之为一步法点突变PCR。如 STRATAGENE公司 Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit所采用的一步法点突变PCR。 原理 采用性能优良的DNA聚合酶 PfuTurbo DNa polymerase,设计出含有突变位点的一对 对应的引物,将含有目的基因的载体加热解链,退火时,突变引物会结合到载体插入片段的 相应序列上,并以此作为引物,延伸。该方法可以直接完成数千bp长度的含有插入片段的 整个载体的复制,使复制的DNA含有突变位点。PCR后,PCR产物用DpnI消化原先的模 版,这是因为大多来自于大肠杆菌的DNA是甲基化的,对DpnI敏感,而新延伸的DNA 链则不然。消化后,所消化的质粒未突变链含有大量的切口,在转化大肠杆菌后,大肠杆菌 会依据突变链将切口修补完善,并予以复制。从而完成基因的点突变。由于该技术仅使用 次PCR循环,所以被称为一步法点突变PCR 实验5DNA双脱氧链终止法测序 目的 1.了解目的DNA的序列,如获得的 DDPCR片段。发现中医药改变了某一不明的 mRNA转录水平,而且反转录得到了该mRNA的cDNA,欲观察该cDNA的序列;通过基 因cDNA库的筛选得到基因的全部序列,要求完成测序 2.了解目的基因是否发生了突变、缺失。例如经中医药治疗或处理后是否可以阻止 或纠正病变组织基因组的突变 3.一些实验如 Footprint要求在足迹电泳的一侧有DNA的序列,以明确核蛋白所结合 启动子的区域 鉴定某一基因是否为目的基因
是，时常会碰到两条引物的 Tm 值不一致，或 PCR 反复调整仍不见改善，此时可以考虑 Touch Down PCR 的方法，具体参见本书 RACE PCR 介绍。 7．CG 丰富的 DNA 模版往往不容易扩增，对此，可以采用 DMSO（DIMETHYL SULFOXIDE），用量为 PCR 反应总容积的 1/10。比如将 4ul 的 DMSO 加入 36ul 的 PCR 反 应液，使总容积达 40ul。 8．MgCl2。通常 PCR buffer 中含有 MgCl2，但是由于一些不清楚的原因，有时仍嫌不 足，此时可以适当增加 MgCl2 的浓度。 9．PCR 是一种十分灵敏的实验，对操作技巧要求高，为防止加样误差，建议做复管。 同时，同时进行多个反应时，相同的试剂建议先一道配置，并留有余量，比如 Taq 酶、10×PCR Buffer、dNTP、消毒过的双蒸水等，混匀，这样可以很大程度上避免上样误差。 10．关于电泳参见本书实验 29。 11．关于试管。为提高 PCR 的质量，以及大批量 PCR 反应的操作，目前业已开发出 不同的 PCR 试管。比如为减少管壁导热的延滞，发展出超薄壁的 PCR 试管；为满足批量实 验，发展出排状 PCR 试管，等等。我们在实验中先后使用过一些不同的试管，从操作方便 和安全上看仍喜欢采用 0.5ml 的试管。这样的试管比较结实，不宜引起试管的破裂和同位素 的泄漏，且手持起来方便。 实验 4 点突变 PCR 点突变 PCR 的使用机会越来越多了起来。当研究发现中医药对某些特定基因的具有调 整作用以后，自然要求深入了解实现对该基因调整的具体途径，比如中医药对某基因的调整 是直接的，并通过这样的调整发挥疗效，抑或是间接的；如果这些基因的功能尚不清楚，那 么，哪些部位是主要的功能区，改变了这些功能区会如何；在这些基因中中医药可能对启动 子的哪些部位发生作用，等等，点突变 PCR 技术可以为回答这些疑问提供方便。 本方法是利用 PCR 技术，改变目的基因的个别或若干碱基，使该碱基所处位置的基因 功能发生变化，以观察其意义。例如对于功能基因，可以检测点突变后功能是否发生变化， 以逐步明确功能区的意义；或直接破坏一些已明确的功能区，使该基因失去原有功能；或用 于筛选启动子中的重要序列、增强子的位置，了解一些已知转录调控蛋白及其特定结合序列 的关系，等等。 点突变 PCR 技术的实现主要有两种方法，一种是比较老的办法，叫做两步法点突变 PCR；另一种发展比较晚，并得益于 Taq 酶性能的提高，称之为一步法点突变 PCR。如 STRATAGENE 公司 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 所采用的一步法点突变 PCR。 原理 采用性能优良的 DNA 聚合酶 PfuTurbo DNA polymerase，设计出含有突变位点的一对 对应的引物，将含有目的基因的载体加热解链，退火时，突变引物会结合到载体插入片段的 相应序列上，并以此作为引物，延伸。该方法可以直接完成数千 bp 长度的含有插入片段的 整个载体的复制，使复制的 DNA 含有突变位点。PCR 后，PCR 产物用 Dpn I 消化原先的模 版，这是因为大多来自于大肠杆菌的 DNA 是甲基化的，对 Dpn I 敏感，而新延伸的 DNA 链则不然。消化后，所消化的质粒未突变链含有大量的切口，在转化大肠杆菌后，大肠杆菌 会依据突变链将切口修补完善，并予以复制。从而完成基因的点突变。由于该技术仅使用一 次 PCR 循环，所以被称为一步法点突变 PCR。 实验 5 DNA 双脱氧链终止法测序 目的 1．了解目的 DNA 的序列，如获得的 DDPCR 片段。发现中医药改变了某一不明的 mRNA 转录水平，而且反转录得到了该 mRNA 的 cDNA，欲观察该 cDNA 的序列；通过基 因 cDNA 库的筛选得到基因的全部序列，要求完成测序。 2．了解目的基因是否发生了突变、缺失。例如经中医药治疗或处理后是否可以阻止 或纠正病变组织基因组的突变。 3．一些实验如 Footprint 要求在足迹电泳的一侧有 DNA 的序列，以明确核蛋白所结合 启动子的区域。 鉴定某一基因是否为目的基因
测序有一些不同的方法及其改良法,比如化学降解测序法,九十年代还发展起来多种 自动测序仪,并不断升级换代,给大量的测序工作提供了快捷、便利的条件。若测序工作 不大,或没有自动测序仪,可以采用本实验介绍的方法 原理 1977年, Sanger等报道了用双脱氧核苷三磷酸( ddNTP)作为链终止剂的测序方法 2’、3ˆ ddNTP在脱氧核糖的3ˆ位置缺少羟基,当DNA聚合酶通过其5’三磷酸基团掺入到正 在增长的DNA链后,因其缺乏3'羟基,后继的dNTP不能与之形成磷酸二酯键,从而使 DNA链终止延伸。于是,在DNA合成反应混合物的4种dNTP中加入少量的一种 ddNTP 当DNA合成过程中,随机掺入到正在增长的DNA链上的 ddNTP将终止链的进一步延伸, 这样,以同一DNA为模版所合成的的拷贝链,将是一系列不同长度的核苷酸链,其长度取 决于引物末端到过早出现链终止位置之间的距离。在四组独立的反应体系中,分别加入4 种不同的 ddNTP和一种经标记的dNTP,结果将产生4组长度不均的寡核苷酸,分别终止于 模板链的每一个A、C、G或T的位置上。然后采用能分辩长度仅差一个核苷酸的变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳,把四组反应液加样于凝胶中若干相邻的泳道上,电泳并放射自显影后,从 凝胶的放射自显影片上可直接读出DNA上的核苷酸序列 实验步骤 1.双链DNA测序反应 1) DNA 12ul(3-5ug) 水 2M NaoH/1 mMEDTA 2 ul 37℃10min 2)水 3M NaAC 6 uI 100%乙醇 插入干冰5min 3)离心10min(4℃),吸弃乙醇,移入70%预冷乙醇110ul,离心10min(4℃),吸 弃乙醇,真空离心干燥5min 4)H2O 引物 65℃2min,在室温下10-30min内逐渐降至室温 5)其间,标记4管 GATC,加入 Dideoxy Termination Mix ddg dda ddt ddC 25252525(ul) 放于一侧。于前管加入: 6)0IM DTI I ul 稀释的 Labeling mix(14HO)2ul a["S]dATP 稀释的 Sequenase 混匀(避免气泡),室温下放置5min 7)分别将此液加入 GATC管中: 3.53.53.53.5(u) 37℃水浴10min。分别加入 Stop Solution 4(ul) 75-80℃水浴3min,置于冰上 放入4℃冰箱,待次日电泳 2.灌胶 1)灌胶模具处理 用肥皂水洗净上下玻璃板,清水洗浄。长板灌胶面用海绵沾以100%乙醇擦净,吸取 5ml Repel- silane移至玻璃板上,均匀涂于全板,再倒上一些乙醇,擦遍全板,反复抛光至
测序有一些不同的方法及其改良法，比如化学降解测序法，九十年代还发展起来多种 自动测序仪，并不断升级换代，给大量的测序工作提供了快捷、便利的条件。若测序工作量 不大，或没有自动测序仪，可以采用本实验介绍的方法。 原理 1977 年，Sanger 等报道了用双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链终止剂的测序方法。 2’、3’ddNTP 在脱氧核糖的 3’位置缺少羟基，当 DNA 聚合酶通过其 5’三磷酸基团掺入到正 在增长的 DNA 链后，因其缺乏 3’羟基，后继的 dNTP 不能与之形成磷酸二酯键，从而使 DNA 链终止延伸。于是，在 DNA 合成反应混合物的 4 种 dNTP 中加入少量的一种 ddNTP， 当 DNA 合成过程中，随机掺入到正在增长的 DNA 链上的 ddNTP 将终止链的进一步延伸， 这样，以同一 DNA 为模版所合成的的拷贝链，将是一系列不同长度的核苷酸链，其长度取 决于引物末端到过早出现链终止位置之间的距离。在四组独立的反应体系中，分别加入 4 种不同的 ddNTP 和一种经标记的 dNTP，结果将产生 4 组长度不均的寡核苷酸，分别终止于 模板链的每一个 A、C、G 或 T 的位置上。然后采用能分辩长度仅差一个核苷酸的变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳，把四组反应液加样于凝胶中若干相邻的泳道上，电泳并放射自显影后，从 凝胶的放射自显影片上可直接读出 DNA 上的核苷酸序列。 实验步骤 1．双链 DNA 测序反应 1） DNA 12 ul（3-5ug） 水 6 ul 2M NaOH/1 mM EDTA 2 ul 37℃ 10 min 2）水 7 ul 3M NaAC 6 ul 100％乙醇 75 ul 插入干冰 5 min 3）离心 10 min（4℃），吸弃乙醇，移入 70％预冷乙醇 110ul，离心 10 min（4℃），吸 弃乙醇，真空离心干燥 5 min。 4） H2O 6 ul 引物 2 ul Sequence Buffer 2 ul 65℃ 2 min，在室温下 10-30 min 内逐渐降至室温。 5）其间，标记 4 管： G A T C ，加入： Dideoxy Termination Mix ddG ddA ddT ddC 2.5 2.5 2.5 2.5 （ul） 放于一侧。于前管加入： 6）0.1M DTT 1 ul 稀释的 Labeling Mix（1:4 H2O）2 ul α[35S]dATP 1 ul 稀释的 Sequenase 2 ul 混匀（避免气泡），室温下放置 5 min。 7）分别将此液加入 G A T C 管中： 3.5 3.5 3.5 3.5 （ul） 37℃水浴 10 min。分别加入： Stop Solution 4 4 4 4 （ul） 75-80℃水浴 3 min，置于冰上。 放入 4℃冰箱，待次日电泳。 2．灌胶 1）灌胶模具处理 用肥皂水洗净上下玻璃板，清水洗净。长板灌胶面用海绵沾以 100％乙醇擦净，吸取 5ml Repel-silane 移至玻璃板上，均匀涂于全板，再倒上一些乙醇，擦遍全板，反复抛光至
干。短板灌胶面用海绵沾以100%乙醇擦净,待干。0.4mm厚的梳子、垫片( Spacer)洗净 后一并用乙醇拭净,待干。 灌胶架左侧一头撑起,右侧移件拉出。长玻璃板轻轻搁上,进岀水管靠近操作者。板 的两侧放上夹条,近移件端,将夹条长出一侧朝内,缺失一侧向外。夹条用夹子夹住边缘暂 固定。短板灌胶面向下,凹头轻轻搁在长板及夹条之上,平头搁在移件远侧 2)配制6%变性测序胶 5×TBE 12 ml 28.8g 水 48ml,加热磁力搅拌至尿素溶解,然后加入: 40%胶 9 ml 10%过硫酸铵 0.42ml 水→60ml,混匀,灌胶前再加入 四甲基乙二胺( TEMED)18uL 轻轻混匀后立刻灌胶。 轻轻倾倒胶至短板前的凹侧内,见凝胶渗抵长板下缘后,左手按短板前侧,右手托移 件之端,向前移动,速度以长板下缘凝胶不被带起,出现气泡和因移动过慢而泄漏:另一人 保持不断倾倒凝胶,以不溢出凹侧为度。待短板两侧突起抵长板及夹条上缘后,即刻放平灌 胶架,两侧用夹子夹紧,左侧前缘插入梳子。前后两侧包以保鲜膜,以防凝胶干燥。通常放 过尊以上介绍的是DNA测序工作站的灌胶方式,不同测序模具有不同的方法,比如由注 射器底部灌胶法、加样瓶上部灌胶法等。具体可以参考有关实验室相应仪器的说明书 3.电泳 1)预电泳 揭去模具两端的保鲜膜,将模具固定至电泳架上。接通模具上端与电泳架上端的恒温 水浴接头。上下缓冲液槽内注入1×TBE电泳缓冲液,各约1000m。轻轻拔去疏子,立即冲 洗上样孔。开启恒温水浴,温度设置在55℃。接通并开启电源,1500V预电泳半小时, 2)上样电泳 再次冲洗上样孔。自冰箱内取出样品,按G、A、T、C、G、A、T、C次序上样,每 孔上样2.5ul,每一样品分上样两孔。上样时,吸头插入上样孔内的上部,轻轻推入样品, 样品因比重较大,会自动沉入孔底。上样要轻而快,上样毕迅速开启电源电泳。电压调至 200ⅴ。电泳时间长短通常视拟测序列位置而定,如从起始部测起,当溴酚蓝抵达凝胶的下 三分之一时,即可停止电泳 4.干胶、曝光 1)干胶 放掉电泳缓冲液,卸下凝胶模具,轻轻撬起短玻璃板,撬时,左手抵住玻璃板对侧 以防玻璃板滑动,破坏凝胶。翻转玻璃,平置桌上。用略大于胶面的滤纸覆于胶上,轻轻按 平,使胶粘于滤纸之上。捏住胶上滤纸一角,轻轻揭起凝胶,胶面向上,放于干燥器滤纸之 上。开启凝胶干燥器,调至80℃,揭开盖膜,铺一张相冋同大小的滤纸于干燥面上(以防真 空干燥时,同位素透过粘于胶上的滤纸,污染干燥器:亦可防止干燥器上已污染的同位素反 过来再污染待干燥的凝胶,影响结果分析)。胶面盖以保鲜膜,开启真空泵,铺平保鲜膜 以免漏气。盖上盖膜。真空干燥80-100分钟。 2)曝光 于暗房内,打开暗盒,置ⅹ光胶片于增感屏上,将烘干的凝胶胶面朝ⅹ光片,盖上暗 盒。置暗盒于避光干燥处。曝光3天。常规冲片,视显影深浅延长或缩短曝光时间 5.读片 读片方法同前图示。参照引物之后部分已知序列,读出所测序列,并确认上样次序是 否有误 实验结果
干。短板灌胶面用海绵沾以 100％乙醇擦净，待干。0.4mm 厚的梳子、垫片（Spacer）洗净 后一并用乙醇拭净，待干。 灌胶架左侧一头撑起，右侧移件拉出。长玻璃板轻轻搁上，进出水管靠近操作者。板 的两侧放上夹条，近移件端，将夹条长出一侧朝内，缺失一侧向外。夹条用夹子夹住边缘暂 固定。短板灌胶面向下，凹头轻轻搁在长板及夹条之上，平头搁在移件远侧。 2）配制 6％变性测序胶 5×TBE 12 ml 尿素 28.8 g 水 → 48 ml，加热磁力搅拌至尿素溶解，然后加入： 40％胶 9 ml 10％过硫酸铵 0.42 ml 水 → 60 ml，混匀，灌胶前再加入 四甲基乙二胺（TEMED） 18 ul 轻轻混匀后立刻灌胶。 3）灌胶 轻轻倾倒胶至短板前的凹侧内，见凝胶渗抵长板下缘后，左手按短板前侧，右手托移 件之端，向前移动，速度以长板下缘凝胶不被带起，出现气泡和因移动过慢而泄漏；另一人 保持不断倾倒凝胶，以不溢出凹侧为度。待短板两侧突起抵长板及夹条上缘后，即刻放平灌 胶架，两侧用夹子夹紧，左侧前缘插入梳子。前后两侧包以保鲜膜，以防凝胶干燥。通常放 过夜。 以上介绍的是 DNA 测序工作站的灌胶方式，不同测序模具有不同的方法，比如由注 射器底部灌胶法、加样瓶上部灌胶法等。具体可以参考有关实验室相应仪器的说明书。 3．电泳 1）预电泳 揭去模具两端的保鲜膜，将模具固定至电泳架上。接通模具上端与电泳架上端的恒温 水浴接头。上下缓冲液槽内注入 1×TBE 电泳缓冲液，各约 1000ml。轻轻拔去疏子，立即冲 洗上样孔。开启恒温水浴，温度设置在 55℃。接通并开启电源，1500V 预电泳半小时。 2）上样电泳 再次冲洗上样孔。自冰箱内取出样品，按 G、A、T、C、G、A、T、C 次序上样，每 孔上样 2.5ul，每一样品分上样两孔。上样时，吸头插入上样孔内的上部，轻轻推入样品， 样品因比重较大，会自动沉入孔底。上样要轻而快，上样毕迅速开启电源电泳。电压调至 2000V。电泳时间长短通常视拟测序列位置而定，如从起始部测起，当溴酚蓝抵达凝胶的下 三分之一时，即可停止电泳。 4．干胶、曝光 1）干胶 放掉电泳缓冲液，卸下凝胶模具，轻轻撬起短玻璃板，撬时，左手抵住玻璃板对侧， 以防玻璃板滑动，破坏凝胶。翻转玻璃，平置桌上。用略大于胶面的滤纸覆于胶上，轻轻按 平，使胶粘于滤纸之上。捏住胶上滤纸一角，轻轻揭起凝胶，胶面向上，放于干燥器滤纸之 上。开启凝胶干燥器，调至 80℃，揭开盖膜，铺一张相同大小的滤纸于干燥面上（以防真 空干燥时，同位素透过粘于胶上的滤纸，污染干燥器；亦可防止干燥器上已污染的同位素反 过来再污染待干燥的凝胶，影响结果分析）。胶面盖以保鲜膜，开启真空泵，铺平保鲜膜， 以免漏气。盖上盖膜。真空干燥 80-100 分钟。 2）曝光 于暗房内，打开暗盒，置 X 光胶片于增感屏上，将烘干的凝胶胶面朝 X 光片，盖上暗 盒。置暗盒于避光干燥处。曝光 3 天。常规冲片，视显影深浅延长或缩短曝光时间。 5．读片 读片方法同前图示。参照引物之后部分已知序列，读出所测序列，并确认上样次序是 否有误。 实验结果