上海中医药大学 《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案(3) 课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48 专业中医基础和中医临床专业 授课教师方肇勤、管冬元、潘志强 内酶切质粒、电泳分离插入片断、凝胶中回收DNA时|7 容|片段 次了解限制性内切酶及其生物学特性 课目的要求 目掌握选用内切酶切割质粒的理论与技术 电泳鉴定酶切结果的理论与技术 从凝胶中回收DNA的理论与技术 次限制性内切酶及其生物学特性 课的重点难 的限制性内切酶切割质粒及常见问题 灌制凝胶 点电泳鉴定酶切结果与分析。 从凝胶中回收DNA 次内切酶切割质粒实验及有关仪器设备。 课 的电泳鉴定酶切实验及有关仪器设备。 应用教具 从凝胶中回收DNA实验及有关仪器设备
上海中医药大学 《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（3） 课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤、管冬元、潘志强 内 容 酶切质粒、电泳分离插入片断、凝胶中回收 DNA 片段 时 数 7 本 次 课 目 的 要 求 了解限制性内切酶及其生物学特性。 掌握选用内切酶切割质粒的理论与技术。 电泳鉴定酶切结果的理论与技术。 从凝胶中回收 DNA 的理论与技术。 本 次 课 的 重 点 难 点 限制性内切酶及其生物学特性。 限制性内切酶切割质粒及常见问题。 灌制凝胶。 电泳鉴定酶切结果与分析。 从凝胶中回收 DNA。 本 次 课 的 应 用 教 具 内切酶切割质粒实验及有关仪器设备。 电泳鉴定酶切实验及有关仪器设备。 从凝胶中回收 DNA 实验及有关仪器设备
实验29 酶切重组质粒,电泳分离所插入的DNA 实验目的 1.鉴定。鉴定所培养的单菌落中是否含有重组质粒,或仅含有自身环化的质粒。如 前所述,前者电泳后会出现大小不等的两条DNA条带,一条为线性质粒载体的DNA,另 一条为插入的目的基因:后者仅有一条载体的DNA条带。比如 DDPCR、 RACEPCR、细胞 库筛选、基因重组,等 2.收获。通过电泳分离,使载体与插入目的基因分开,便于分别回收载体和已大量 扩增了的插入目的基因。比如探针用片段。 .本实验由2个部分组成 1)酶切重组质粒; 2)DNA的琼脂糖凝胶电泳(纯化的方法)。 关于限制性内切酶 本实验选用的限制性内切酶是分子生物学中最为常用的工具酶。通常不同的限制性内 切酶分别能识别一小段双链DNA序列,长度多在4-6个核苷酸,且呈双重对称的DNA序 列,并将其切断 利用这种特性,可以选择适当的酶来切割所需的DNA片段,或选择适当的酶切开载 体,造成载体的粘端序列与插入DNA的粘端序列相同,以便于重组质粒。具体酶的特性 识别位点等可以参考不同公司的试剂目录(见图)。 四.琼脂糖凝胶电泳介绍 DNA的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中使用广泛的技术,该技术利用DNA分子 在电场下向电场一极迁徙的特性,在pH中性的条件下,DNA分子由阴极向阳极迁徙。其 间,DNA分子量大,摩擦阻力大,在凝胶的孔隙中迁徙得慢:分子量小,摩擦阻力小,迁 徙快,在电泳一定时间后,大小不等得DNA分子可以得到有效得分离。同样分子量的DNA 环状的较线性的迁徙速度快。分离的DNA可以方便地用溴乙锭染色,方法是1)在灌胶时 直接把溴乙锭混入凝胶,或2)电泳后将凝胶浸入溴乙锭染液(我们推荐前者),染色后在 紫外透射灯下可以看到橘红色的DNA条带,在一般实验室最低分辨能力(肉眼可见的)约 为50-100ng。 电泳仪介绍(见图)。 电泳仪放法(见图)。 原理 采用限制性内切酶 EcoR I切开插入DNA与质粒载体,将这一反应液上样于琼脂糖凝 胶,电泳,使分子量小的插入DNA前移,并与分子量大的在电泳中滞后的质粒载体DNA 分开。(见图) 实验准备(略) 实验步骤 1.酶切质粒 取一洁净的15 ml Eppendorf管,编好号,插入冰中,依次加入: 水 7ul 10×缓冲液 重组质粒 10ul
实验 29 酶切重组质粒，电泳分离所插入的 DNA 一．实验目的 1．鉴定。鉴定所培养的单菌落中是否含有重组质粒，或仅含有自身环化的质粒。如 前所述，前者电泳后会出现大小不等的两条 DNA 条带，一条为线性质粒载体的 DNA，另 一条为插入的目的基因；后者仅有一条载体的 DNA 条带。比如 DDPCR、RACEPCR、细胞 库筛选、基因重组，等。 2．收获。通过电泳分离，使载体与插入目的基因分开，便于分别回收载体和已大量 扩增了的插入目的基因。比如探针用片段。 二．本实验由 2 个部分组成： 1）酶切重组质粒； 2）DNA 的琼脂糖凝胶电泳（纯化的方法）。 三．关于限制性内切酶 本实验选用的限制性内切酶是分子生物学中最为常用的工具酶。通常不同的限制性内 切酶分别能识别一小段双链 DNA 序列，长度多在 4-6 个核苷酸，且呈双重对称的 DNA 序 列，并将其切断。 利用这种特性，可以选择适当的酶来切割所需的 DNA 片段，或选择适当的酶切开载 体，造成载体的粘端序列与插入 DNA 的粘端序列相同，以便于重组质粒。具体酶的特性、 识别位点等可以参考不同公司的试剂目录（见图）。 四．琼脂糖凝胶电泳介绍 DNA 的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中使用广泛的技术，该技术利用 DNA 分子 在电场下向电场一极迁徙的特性，在 pH 中性的条件下，DNA 分子由阴极向阳极迁徙。其 间，DNA 分子量大，摩擦阻力大，在凝胶的孔隙中迁徙得慢；分子量小，摩擦阻力小，迁 徙快，在电泳一定时间后，大小不等得 DNA 分子可以得到有效得分离。同样分子量的 DNA 环状的较线性的迁徙速度快。分离的 DNA 可以方便地用溴乙锭染色，方法是 1）在灌胶时 直接把溴乙锭混入凝胶，或 2）电泳后将凝胶浸入溴乙锭染液（我们推荐前者），染色后在 紫外透射灯下可以看到橘红色的 DNA 条带，在一般实验室最低分辨能力（肉眼可见的）约 为 50-100ng。 电泳仪介绍（见图）。 电泳仪放法（见图）。 原 理 采用限制性内切酶 EcoR I 切开插入 DNA 与质粒载体，将这一反应液上样于琼脂糖凝 胶，电泳，使分子量小的插入 DNA 前移，并与分子量大的在电泳中滞后的质粒载体 DNA 分开。（见图） 实验准备（略） 实验步骤 1．酶切质粒 取一洁净的 1.5ml Eppendorf 管，编好号，插入冰中，依次加入： 水 7ul 10×缓冲液 2ul 重组质粒 10ul EcoR I 1ul
20ul 盖上盖,混匀,将反应物甩入管底,置37℃水浴中温育1小时。 2.灌胶 将粘胶纸粘于灌胶模槽的两端,制成灌胶模。放入梳子。将模放于水平台上。 取一烧杯,放入 琼脂糖 1.2g 5×TBE 79 ml 混匀,加热,至琼脂糖彻底溶解。待稍冷后,加入5u饱和的溴乙锭,轻晃混匀,然 后轻轻倒入模子。用吸头吸去表面小泡。待冷却成胶 如果梳子大且角锐利,应该离模具底部远些,以防拔梳子时将凝胶底部拔穿 3.上样电泳 将胶两头粘胶纸揭去,移入电泳槽,梳子一侧靠近操作者,注入1×TBE缓冲液,浸没 凝胶,轻轻拔出梳子。接上电源:阳极远离上样孔,阴极靠近上样孔(DNA向阳极移动) 加3ul上样缓冲液入酶切反应液,混匀,插入冰内。加lu上样缓冲液入3ul小量制备的重 组质粒,混匀,插入冰内。上样次序:由右向左。(幻灯)。第一孔:3u标准品梯度DNA 第二孔:3ul未经切割的重组质粒DNA,第三孔:10u含上样缓冲液的酶切反应液。加样时, 加样头尖端插入上样孔内1/3高度,轻轻将样品推入,使比重较大的样品自然沉入上样孔底 避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部(幻灯)。开启电源,电压调至100V。通常半小时 后检查 实验结果 置凝胶于长波紫外透射仪上,可见清晰的呈淡橘红色的标准品若干梯度条带、一条对 应于20002500bp的未被切割的环状含插入片段的质粒和分别对应于250bp和3000的两 条DNA条带。前面一条约250bp的DNA条带即放大了的插入DNA片段,后面一条为线状 的质粒DNA(见图)。 注意事项 1.若所制备的质粒不能被内切酶切割,可用酚/氯仿抽提一次。 2.如前所述,一些限制性内切酶对乙醇敏感,比如 EcoR I。一旦样品有痕量乙醇污 染,会引起酶的失活,难以切开DNA。此时,可以将样品试管开盖,置于70℃干浴器中若 干分钟,使乙醇逐渐挥发,这样十分有效。 3.常见错误 (1)溶解凝胶时,凝胶沸腾后立即外溢。因此,加热溶解凝胶时操作人员不能离开 (2)上样的错误:前后左右和底部的凝胶被刺破,样品漏掉或电泳条带的形态不好。 尤其是底部刺穿,样品遗失十分可惜。形成原因是没有经验和手法不妤。介绍手法。另外, 样品温度过高或上样缓冲液含量不够,比重不够,上样时样品漂浮起来,溢出孔外。 3)电极放反。有时电极没有放反,但接入电源时被接反,结果一样,使DNA样品 倒迁徙,立即移出凝胶,工作失败。因此,建议电泳前仔细检查,电泳一段时间后,观察染 料确实向前移出后,方可离开 (4)电泳时间过头。电泳时间通常视分离片段的大小而定,一般为半小时至1小时 如果电泳时间过长,目的DNA可能会迁移出凝胶外,实验失败。因此建议使用定时器或含 有定时功能的电泳电源 5)凝胶自灌胶模具上滑落下来。由于观察电泳结果要将凝胶自灌胶模具推移至紫 外透射仪上,且往往紫外透射仪安放在暗室,这样需要将凝胶自电泳槽中移出,搬迁。在此 过程中容易发生凝胶自灌胶模具上滑落。避免的方法是以食指抵在灌胶模具槽的一端,槽向 食指倾斜,使凝胶靠在食指上,左右由于有槽的两侧侧壁护着,保证凝胶不致滑落。 (6)凝胶滑入电泳缓冲液。当紫外透射观察后,如果不同片段的分离尚不彻底,需 要进一步电泳时,要将凝胶放回电泳槽。此时,凝胶因脱离过模具,粘附不紧,容易自模具
20ul 盖上盖，混匀，将反应物甩入管底，置 37℃水浴中温育 1 小时。 2．灌胶 将粘胶纸粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。放入梳子。将模放于水平台上。 取一烧杯，放入： 琼脂糖 1.2 g 5×TBE 20 ml 水 79 ml 100 ml 混匀，加热，至琼脂糖彻底溶解。待稍冷后，加入 5ul 饱和的溴乙锭，轻晃混匀，然 后轻轻倒入模子。用吸头吸去表面小泡。待冷却成胶。 如果梳子大且角锐利，应该离模具底部远些，以防拔梳子时将凝胶底部拔穿。 3．上样电泳 将胶两头粘胶纸揭去，移入电泳槽，梳子一侧靠近操作者，注入 1×TBE 缓冲液，浸没 凝胶，轻轻拔出梳子。接上电源：阳极远离上样孔，阴极靠近上样孔（DNA 向阳极移动）。 加 3ul 上样缓冲液入酶切反应液，混匀，插入冰内。加 1ul 上样缓冲液入 3ul 小量制备的重 组质粒，混匀，插入冰内。上样次序：由右向左。（幻灯）。第一孔：3ul 标准品梯度 DNA， 第二孔：3ul 未经切割的重组质粒 DNA，第三孔：10ul 含上样缓冲液的酶切反应液。加样时， 加样头尖端插入上样孔内 1/3 高度，轻轻将样品推入，使比重较大的样品自然沉入上样孔底。 避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部（幻灯）。开启电源，电压调至 100V。通常半小时 后检查。 实验结果 置凝胶于长波紫外透射仪上，可见清晰的呈淡橘红色的标准品若干梯度条带、一条对 应于 2000-2500bp 的未被切割的环状含插入片段的质粒和分别对应于 250bp 和 3000bp 的两 条 DNA 条带。前面一条约 250bp 的 DNA 条带即放大了的插入 DNA 片段，后面一条为线状 的质粒 DNA（见图）。 注意事项 1．若所制备的质粒不能被内切酶切割，可用酚/氯仿抽提一次。 2．如前所述，一些限制性内切酶对乙醇敏感，比如 EcoR I。一旦样品有痕量乙醇污 染，会引起酶的失活，难以切开 DNA。此时，可以将样品试管开盖，置于 70℃干浴器中若 干分钟，使乙醇逐渐挥发，这样十分有效。 3．常见错误 （1）溶解凝胶时，凝胶沸腾后立即外溢。因此，加热溶解凝胶时操作人员不能离开。 （2）上样的错误：前后左右和底部的凝胶被刺破，样品漏掉或电泳条带的形态不好。 尤其是底部刺穿，样品遗失十分可惜。形成原因是没有经验和手法不好。介绍手法。另外， 样品温度过高或上样缓冲液含量不够，比重不够，上样时样品漂浮起来，溢出孔外。 （3）电极放反。有时电极没有放反，但接入电源时被接反，结果一样，使 DNA 样品 倒迁徙，立即移出凝胶，工作失败。因此，建议电泳前仔细检查，电泳一段时间后，观察染 料确实向前移出后，方可离开。 （4）电泳时间过头。电泳时间通常视分离片段的大小而定，一般为半小时至 1 小时。 如果电泳时间过长，目的 DNA 可能会迁移出凝胶外，实验失败。因此建议使用定时器或含 有定时功能的电泳电源。 （5）凝胶自灌胶模具上滑落下来。由于观察电泳结果要将凝胶自灌胶模具推移至紫 外透射仪上，且往往紫外透射仪安放在暗室，这样需要将凝胶自电泳槽中移出，搬迁。在此 过程中容易发生凝胶自灌胶模具上滑落。避免的方法是以食指抵在灌胶模具槽的一端，槽向 食指倾斜，使凝胶靠在食指上，左右由于有槽的两侧侧壁护着，保证凝胶不致滑落。 （6）凝胶滑入电泳缓冲液。当紫外透射观察后，如果不同片段的分离尚不彻底，需 要进一步电泳时，要将凝胶放回电泳槽。此时，凝胶因脱离过模具，粘附不紧，容易自模具
中滑入槽内的电泳缓冲液中。若未及时发现,通电后会造成DNA迁徙出凝胶。因此要求凝 胶确保未移动后方可通电继续电泳。 (7)凝胶浓度不对。过浓或过稀。介绍手册上的方法:大约小片段(100bp左右)用 2%左右凝胶,大片段(500bp以上)用1%左右,可以用到0.8% (8)电泳缓冲液比例或内容不对,偶尔也可以见到 4.电泳后的DNA条带会在凝胶中自行扩散,因此要求电泳后立即观察,以免条带扩 散 实验30从凝胶中回收DNA 实验目的 从凝胶中回收DNA是分子生物学中经常要做的工作。为此,已发展了许多方法,比 1)低熔点凝胶 2)透析袋电泳分离 3)凝胶挖槽电泳分离 4)用 QIAquick Gel Extraction Kits回收凝胶中的DNA 由于后者具有效率高、所回收DNA的纯度高,且能大大缩短了实验的时间,业已形 成产品。然而,我们在比较以上不同的实验方法时发现,采用S&SNA45DEAE膜DNA的 回收率最高,并具有很高的纯度,是一种值得推荐的方法,因此本实验介绍S&SNA45DEAE 膜DNA的回收方法。 原理 本实验所用的S&SNA45DEAE膜上有045um的微孔,当电泳时,DNA与RNA可 被该膜所阻拦,并结合到该膜上。通常,该膜每平方厘米上可结合7ug的DNA或RNA,最 大可达到20ug。用NET缓冲液洗去膜上的残留凝胶,再用高盐NET将DNA从膜上洗脱下 来,通过乙醇沉淀,可得到纯净的DNA 实验准备(略) 实验步骤 1.停止电泳,在拟分离回收的DNA之前,用单面刀片在凝胶上切一条垂直的缝,用 扁头镊将NA膜缓缓插入缝中,下缘抵凝胶底部。如所分离DNA条带之后紧跟有另一DNA 条带,为避免污染,可在两条DNA带之间插入另一张NA膜,起到阻隔随后DNA的作用。 (幻灯) 2.继续电泳,在长波紫外透射灯下观察DNA条带全部结合到膜上,停止电泳 3.取出膜,迅速在NET缓冲液中晃洗,以去除膜上残留的凝胶。剪去不含DNA的 膜(可在长波紫外透射灯下操作)。 4.将含DNA的膜放入 Eppendorf管中,移入150~250u高盐NET缓冲液,使膜浸没 于高盐NET缓冲液中,于65℃水浴中温育15分钟,间或混匀一下。 5.移出高盐NET缓冲液入一新管,以另50ul高盐NET缓冲液洗膜一次。 6.汇合两次高盐NET缓冲液,加两倍体积的无水乙醇,混匀 7.置-20℃冰箱内存放5小时。 8.在4℃下,1.4万转离心10分钟,弃上清,迅速移入预冷的75%乙醇,在4℃下, 14万转离心10分钟,弃上清 9.离心真空干燥2~4分钟 10.视所分离DNA的量,以适量的水,约10-20ul,溶解DNA于冰上。 实验结果 DNA的回收率应在90%以上
中滑入槽内的电泳缓冲液中。若未及时发现，通电后会造成 DNA 迁徙出凝胶。因此要求凝 胶确保未移动后方可通电继续电泳。 （7）凝胶浓度不对。过浓或过稀。介绍手册上的方法：大约小片段（100bp 左右）用 2%左右凝胶，大片段（500bp 以上）用 1%左右，可以用到 0.8%。 （8）电泳缓冲液比例或内容不对，偶尔也可以见到。 4．电泳后的 DNA 条带会在凝胶中自行扩散，因此要求电泳后立即观察，以免条带扩 散。 实验 30 从凝胶中回收 DNA 实验目的 从凝胶中回收 DNA 是分子生物学中经常要做的工作。为此，已发展了许多方法，比 如： 1）低熔点凝胶。 2）透析袋电泳分离。 3）凝胶挖槽电泳分离。 4）用 QIAquick Gel Extraction Kits 回收凝胶中的 DNA。 由于后者具有效率高、所回收 DNA 的纯度高，且能大大缩短了实验的时间，业已形 成产品。然而，我们在比较以上不同的实验方法时发现，采用 S&S NA45 DEAE 膜 DNA 的 回收率最高，并具有很高的纯度，是一种值得推荐的方法，因此本实验介绍 S&S NA45 DEAE 膜 DNA 的回收方法。 原 理 本实验所用的 S&S NA45 DEAE 膜上有 0.45um 的微孔，当电泳时，DNA 与 RNA 可 被该膜所阻拦，并结合到该膜上。通常，该膜每平方厘米上可结合 7ug 的 DNA 或 RNA，最 大可达到 20ug。用 NET 缓冲液洗去膜上的残留凝胶，再用高盐 NET 将 DNA 从膜上洗脱下 来，通过乙醇沉淀，可得到纯净的 DNA。 实验准备（略） 实验步骤 1．停止电泳，在拟分离回收的 DNA 之前，用单面刀片在凝胶上切一条垂直的缝，用 扁头镊将 NA 膜缓缓插入缝中，下缘抵凝胶底部。如所分离 DNA 条带之后紧跟有另一 DNA 条带，为避免污染，可在两条 DNA 带之间插入另一张 NA 膜，起到阻隔随后 DNA 的作用。 （幻灯） 2．继续电泳，在长波紫外透射灯下观察 DNA 条带全部结合到膜上，停止电泳。 3．取出膜，迅速在 NET 缓冲液中晃洗，以去除膜上残留的凝胶。剪去不含 DNA 的 膜（可在长波紫外透射灯下操作）。 4．将含 DNA 的膜放入 Eppendorf 管中，移入 150~250ul 高盐 NET 缓冲液，使膜浸没 于高盐 NET 缓冲液中，于 65℃水浴中温育 15 分钟，间或混匀一下。 5．移出高盐 NET 缓冲液入一新管，以另 50ul 高盐 NET 缓冲液洗膜一次。 6．汇合两次高盐 NET 缓冲液，加两倍体积的无水乙醇，混匀。 7．置-20℃冰箱内存放 5 小时。 8．在 4℃下，1.4 万转离心 10 分钟，弃上清，迅速移入预冷的 75％乙醇，在 4℃下， 1.4 万转离心 10 分钟，弃上清。 9．离心真空干燥 2~4 分钟。 10．视所分离 DNA 的量，以适量的水，约 10-20ul，溶解 DNA 于冰上。 实验结果 DNA 的回收率应在 90％以上
注意事项 1.电泳时间严格控制,不可以过头,以免污染 2.整个实验过程中,不可使膜干燥。 3.注意防止凝胶断裂,尤其在切割以后。但是,断裂了不要担心,可以仔细拼上 续电泳。 高盐和低盐缓冲液千万不可以搞错
注意事项 1．电泳时间严格控制，不可以过头，以免污染。 2．整个实验过程中，不可使膜干燥。 3．注意防止凝胶断裂，尤其在切割以后。但是，断裂了不要担心，可以仔细拼上， 继续电泳。 4．高盐和低盐缓冲液千万不可以搞错