大孔吸附树脂从藻粉中分离纯化微囊藻毒素

D0L:10.13374.issn1001-053x.2013.10.001 第35卷第10期 北京科技大学学报 Vol.35 No.10 2013年10月 Journal of University of Science and Technology Beijing 0ct.2013 大孔吸附树脂从藻粉中分离纯化微囊藻毒素 曹艳秋)，弓爱君1)☒，李红梅)，李宝芹1)，邱丽娜1) 1)北京科技大学化学与生物工程学院，北京100083 2)中国计量科学研究化学计量与分析科学研究所，北京100013 ☒通信作者，E-mail:gongaijun@ustb.cdu.cn 摘要比较了XAD-2树脂和DlO1树脂分别从天然藻粉粗品中吸附分离微囊藻毒素(Microcystin-LR,MC-LR)的结 果，讨论了用不同体积分数的乙酸、丙酮和乙醇溶液淋洗去除树脂吸附杂质的效果.实验结果表明：XAD-2树脂分离 效果优于D101树脂.对于采用XAD-2树脂吸附分离得到的微囊藻毒素MC-LR,采用体积分数40%乙酸、10%丙酮和 20%乙醇溶液淋洗杂质的效果较好，采用体积分数60%的甲醇水溶液洗脱微囊藻毒素MC-LR可以获得最大产品质量 浓度，并且该纯化方法重现性良好 关键词多孔材料：树脂：藻类：微囊藻毒素：分离：纯化 分类号065 Separation and purification of microcystins in algae crude powder with macroporous resin CAO Yan-qiu),GONG Ai-jun),LI Hong-me),LI Bao-qin),QIU Li-na) 1)School of Chemistry and Biological Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China 2)Chemical Metrology Analytical Science Division,National Institute of Metrology,Beijing 100013,China Corresponding author,E-mail:gongaijun@ustb.edu.cn ABSTRACT XAD-2 resin and D101 resin were compared on adsorption separation of Microcystin-LR(MC-LR)in algae crude powder.Removal effects of impurities adsorbed on these resins with microcystins (MCs)by acetic acid, acetone and ethanol were discussed at different volume fractions.It is shown that XAD-2 resin has a better purification effect than D101 resin.When MC-LR purified by XAD-2 resin is leached by acetic acid,acetone and ethanol to remove the impurities,the optimum volume fraction is 40%for acetic acid,10%for acetone and 20%for ethanol,respectively. When eluted with 60%methanol solution,MC-LR can reach its maximum mass fraction,and this purification method is well reproducible. KEY WORDS porous materials;resins;algae;microcystins;separation;purification 目前，蓝藻水华污染现象已呈全球性分布，染并威胁到水生食品安全.作为一种潜在的肿瘤促 蓝藻死亡后会向水体中释放微囊藻毒素(Micro- 进剂，微量微囊藻毒素的长期摄入会给人体造成较 cystins,.MCs).微囊藻毒素是一类环状七肽化合物， 高的患癌风险，其中主要靶器官在肝脏冈.目前微 具有80余种变体四，其中微囊藻毒素MC-LR毒性 囊藻毒素在水源地及水生食品中的监测、降解方法 最强.世界卫生组织规定：饮用水中MC-LR质量浓 及其在环境中的分布、迁移、积累、归宿等研究都 度不得高于1gL-1.这是由于微囊藻毒素不仅危 在逐步开展阁，但是国内高纯度微囊藻毒素固体产 害水中动植物的生长和发育，还会引起饮用水源污 品及其标准品的缺乏已成为深入进行上述研究的障 收稿日期：2013-04-12 基金项目：北京科技大学治金工程研究院资助项目(YJ2009-016)

第 35 卷 第 10 期 北 京 科 技 大 学 学 报 Vol. 35 No. 10 2013 年 10 月 Journal of University of Science and Technology Beijing Oct. 2013 大孔吸附树脂从藻粉中分离纯化微囊藻毒素 曹艳秋1)，弓爱君1) ，李红梅2)，李宝芹1)，邱丽娜1) 1) 北京科技大学化学与生物工程学院，北京 100083 2) 中国计量科学研究化学计量与分析科学研究所，北京 100013 通信作者，E-mail: gongaijun@ustb.edu.cn 摘 要 比较了 XAD-2 树脂和 D101 树脂分别从天然藻粉粗品中吸附分离微囊藻毒素 (Microcystin-LR, MC-LR) 的结 果，讨论了用不同体积分数的乙酸、丙酮和乙醇溶液淋洗去除树脂吸附杂质的效果. 实验结果表明：XAD-2 树脂分离 效果优于 D101 树脂. 对于采用 XAD-2 树脂吸附分离得到的微囊藻毒素 MC-LR，采用体积分数 40%乙酸、10%丙酮和 20% 乙醇溶液淋洗杂质的效果较好，采用体积分数 60%的甲醇水溶液洗脱微囊藻毒素 MC-LR 可以获得最大产品质量 浓度，并且该纯化方法重现性良好. 关键词 多孔材料；树脂；藻类；微囊藻毒素；分离；纯化 分类号 O65 Separation and purification of microcystins in algae crude powder with macroporous resin CAO Yan-qiu1), GONG Ai-jun1) , LI Hong-mei2), LI Bao-qin1), QIU Li-na1) 1) School of Chemistry and Biological Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China 2) Chemical Metrology & Analytical Science Division , National Institute of Metrology, Beijing 100013, China Corresponding author, E-mail: gongaijun@ustb.edu.cn ABSTRACT XAD-2 resin and D101 resin were compared on adsorption separation of Microcystin-LR (MC-LR) in algae crude powder. Removal effects of impurities adsorbed on these resins with microcystins (MCs) by acetic acid, acetone and ethanol were discussed at different volume fractions. It is shown that XAD-2 resin has a better purification effect than D101 resin. When MC-LR purified by XAD-2 resin is leached by acetic acid, acetone and ethanol to remove the impurities, the optimum volume fraction is 40% for acetic acid, 10% for acetone and 20% for ethanol, respectively. When eluted with 60% methanol solution, MC-LR can reach its maximum mass fraction, and this purification method is well reproducible. KEY WORDS porous materials; resins; algae; microcystins; separation; purification 目前， 蓝藻水华污染现象已呈全球性分布， 蓝藻死亡后会向水体中释放微囊藻毒素 (Micro￾cystins，MCs). 微囊藻毒素是一类环状七肽化合物， 具有 80 余种变体 [1]，其中微囊藻毒素 MC-LR 毒性 最强. 世界卫生组织规定: 饮用水中 MC-LR 质量浓 度不得高于 1 µg·L −1 . 这是由于微囊藻毒素不仅危 害水中动植物的生长和发育，还会引起饮用水源污 染并威胁到水生食品安全. 作为一种潜在的肿瘤促 进剂，微量微囊藻毒素的长期摄入会给人体造成较 高的患癌风险，其中主要靶器官在肝脏 [2] . 目前微 囊藻毒素在水源地及水生食品中的监测、降解方法 及其在环境中的分布、迁移、积累、归宿等研究都 在逐步开展 [3]，但是国内高纯度微囊藻毒素固体产 品及其标准品的缺乏已成为深入进行上述研究的障 收稿日期：2013-04-12 基金项目：北京科技大学冶金工程研究院资助项目 (YJ2009-016) DOI:10.13374/j.issn1001-053x.2013.10.001

第10期 曹艳秋等：大孔吸附树脂从藻粉中分离纯化微囊藻毒素 ·1257· 碍，因此迫切需要建立一种低成本、大规模提取纯 匀粉末 化MCLR的方法.目前国内外对微囊藻毒素进行 天然藻粉]→超声萃取→离心 提纯和制备的方法有吸附法4、萃取法同、膜分离 法间、色谱法)等，较为常用的是制备色谱法8-： 但该方法在技术上存在一定的缺陷，处理样品量少 微囊藻毒素初级粗品←一冷冻干燥 而且成本高.针对上述问题，本文采用易于操作 和放大规模的固相吸附法[对藻毒素的纯化进行 图1从天然藻粉中制备微囊藻毒素初级粗品方法 了研究，即采用大孔树脂吸附天然藻粉中的微囊藻 Fig.1 Preparation method of MC-LR crude powder from 毒素，通过淋洗去除吸附在树脂上的杂质，再把微 natural algae powder 囊藻毒素从树脂上洗脱下来获得较高纯度的微囊藻 1.3.2初级粗品粉末均匀性检验 毒素溶液，从而实现提纯目的，为大规模制备微囊 将制备好的藻粉初级粗品按四分法取点，均匀 藻毒素标准品提供研究基础.固相吸附法是水中微 取16点，每点取量约0.1g,用50mL体积分数 量或痕量微囊藻毒素检测的前处理方法之一，但在 60%的甲醇溶液复溶，采用高效液相色谱检测其中 制备和提纯微囊藻毒素的研究中报道不多.王中婵 微囊藻毒素含量 等4曾就D1300、D101、YRP.Ⅱ、CAD-45、NKA 1.3.3洗脱剂浓度的选择及用量的确定 和AB-8五种大孔树脂对微囊藻毒素的分离情况进 由于甲醇水溶液对微囊藻毒素具有良好溶解 行了研究，表明D101树脂的分离效果最好。本文 性，因此选定甲醇水溶液进行洗脱，但是不同体 通过比较D101树脂和XAD2树脂的分离效果，进 积分数的甲醇水溶液的溶解能力不同，因此需要进 一步提高了分离产物的纯度，并对分离过程进行了 行最佳甲醇体积分数的选择.本文比较了体积分数 细化研究 30%、50%、60%、70%和90%的甲醇水溶液对天然藻 1 实验材料和方法 粉中微囊藻毒素MC-LR的提取效果，将提取液中 1.1实验仪器 微囊藻毒素MC-LR质量浓度最大的那组甲醇水溶 液中甲醇的体积分数定为最佳洗脱剂体积分数 SHIMADZU岛津高效液相色谱仪（紫外-可见 为了确定洗脱液的用量，取一定量微囊藻毒素 检测器配LC solution Lite工作站)，Inerteil ODS-3 初级粉末复溶后吸附到树脂柱上，采用最佳体积分 色谱柱(416mm×250mm,5m),RE52CS旋转蒸 数的甲醇水溶液进行洗脱，用10mL量筒收集流出 发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ-250B超声波清洗 的洗脱液，每流出10mL作为一个样品，编号为1， 器，MILLIPORE超纯水机（美国），高速冷冻离心 2,·,13,共13份10mL样品，再把各个样品浓 机(1-15K,Sigma公司)，0.45m的混合纤维素酯 缩至1L,然后用HPLC检测浓缩后样品中微囊 微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司），四氟乙烯 藻毒素MC-LR的质量浓度.将微囊藻毒素MC-LR 塞50mL滴定管 质量浓度对洗脱液体积作图，得到MC-LR的淋洗 1.2实验试剂 曲线，从而确定洗脱剂的用量 天然藻粉（取自北京市郊区），MC-L标准品 1.3.4大孔树脂纯化方法建立 (Alexis公司)，甲醇（分析纯，北京化学试剂公司）， 取5g树脂湿法装柱，微囊藻毒素初级粗品复 乙酸（分析纯，北京化学试剂公司），丙酮（分析 溶后吸附于树脂，比较分别使用不同用量的乙酸乙 纯，北京化学试剂公司)，三氟乙酸（化学纯，北 酯（由于乙酸乙酯与水混溶比例较低，所以直接使 京化学试剂公司)，XAD-2树脂(SIGMA AMBER- 用乙酸乙酯)淋洗，高效液相色谱实时监测淋洗液 LTE),D101树脂（天津市光复精细化工研究所）. 中微囊藻毒素MC-LR,检测到微囊藻毒素MC-LR 1.3实验方法 色谱峰出现时停止淋洗，记录乙酸乙酯最大用量， 1.3.1微囊藻毒素初级粗品的制备 并用体积分数为60%的甲醇溶液洗脱树脂上的微囊 将一定量天然藻粉置于体积分数60%的甲醇溶 藻毒素，将溶有微囊藻毒素的甲醇溶液旋转蒸发浓 液中超声萃取18mim,然后离心分离，获得的上清 缩至20L,采用高效液相色谱法测定微囊藻毒素 液经真空冷冻干燥12h后，置于70℃恒温烘干24 MCLR的质量浓度，计算获得产品中微囊藻毒素 h,得到微囊藻毒素初级粗品.制备过程如图1所 MCLR质量占原始粗品中微囊藻毒素MC-LR质 示。然后将初级粗品粉碎至100目得到初级粗品均 量之比（回收率），同时通过微囊藻毒素粗品和经过

第 10 期 曹艳秋等：大孔吸附树脂从藻粉中分离纯化微囊藻毒素 1257 ·· 碍，因此迫切需要建立一种低成本、大规模提取纯 化 MC-LR 的方法. 目前国内外对微囊藻毒素进行 提纯和制备的方法有吸附法 [4]、萃取法 [5]、膜分离 法 [6]、色谱法 [7] 等，较为常用的是制备色谱法 [8−9]； 但该方法在技术上存在一定的缺陷，处理样品量少 而且成本高. 针对上述问题，本文采用易于操作 和放大规模的固相吸附法 [10] 对藻毒素的纯化进行 了研究，即采用大孔树脂吸附天然藻粉中的微囊藻 毒素，通过淋洗去除吸附在树脂上的杂质，再把微 囊藻毒素从树脂上洗脱下来获得较高纯度的微囊藻 毒素溶液，从而实现提纯目的，为大规模制备微囊 藻毒素标准品提供研究基础. 固相吸附法是水中微 量或痕量微囊藻毒素检测的前处理方法之一，但在 制备和提纯微囊藻毒素的研究中报道不多. 王中婵 等 [4] 曾就 D1300、D101、YRP- Ⅱ、CAD-45、NKA 和 AB-8 五种大孔树脂对微囊藻毒素的分离情况进 行了研究，表明 D101 树脂的分离效果最好。本文 通过比较 D101 树脂和 XAD2 树脂的分离效果，进 一步提高了分离产物的纯度，并对分离过程进行了 细化研究. 1 实验材料和方法 1.1 实验仪器 SHIMADZU 岛津高效液相色谱仪 (紫外 - 可见 检测器配 LC solution Lite 工作站)，Inerteil ODS-3 色谱柱 (416 mm×250 mm, 5 µm)，RE52CS 旋转蒸 发仪 (上海亚荣生化仪器厂)，KQ-250B 超声波清洗 器，MILLIPORE 超纯水机 (美国)，高速冷冻离心 机 (1-15 K，Sigma 公司)，0.45 µm 的混合纤维素酯 微孔滤膜 (天津津腾实验设备有限公司)，四氟乙烯 塞 50 mL 滴定管. 1.2 实验试剂 天然藻粉 (取自北京市郊区)，MC-LR 标准品 (Alexis 公司)，甲醇 (分析纯，北京化学试剂公司)， 乙酸 (分析纯， 北京化学试剂公司)， 丙酮 (分析 纯，北京化学试剂公司)，三氟乙酸 (化学纯，北 京化学试剂公司)，XAD-2 树脂 (SIGMA AMBER￾LITE)，D101 树脂 (天津市光复精细化工研究所). 1.3 实验方法 1.3.1 微囊藻毒素初级粗品的制备 将一定量天然藻粉置于体积分数 60%的甲醇溶 液中超声萃取 18 min，然后离心分离，获得的上清 液经真空冷冻干燥 12 h 后，置于 70 ℃恒温烘干 24 h，得到微囊藻毒素初级粗品. 制备过程如图 1 所 示。然后将初级粗品粉碎至 100 目得到初级粗品均 匀粉末. 图 1 从天然藻粉中制备微囊藻毒素初级粗品方法 Fig.1 Preparation method of MC-LR crude powder from natural algae powder 1.3.2 初级粗品粉末均匀性检验 将制备好的藻粉初级粗品按四分法取点，均匀 取 16 点，每点取量约 0.1 g，用 50 mL 体积分数 60%的甲醇溶液复溶，采用高效液相色谱检测其中 微囊藻毒素含量. 1.3.3 洗脱剂浓度的选择及用量的确定 由于甲醇水溶液对微囊藻毒素具有良好溶解 性，因此选定甲醇水溶液进行洗脱，但是不同体 积分数的甲醇水溶液的溶解能力不同，因此需要进 行最佳甲醇体积分数的选择. 本文比较了体积分数 30%、50%、60%、70%和 90%的甲醇水溶液对天然藻 粉中微囊藻毒素 MC-LR 的提取效果，将提取液中 微囊藻毒素 MC-LR 质量浓度最大的那组甲醇水溶 液中甲醇的体积分数定为最佳洗脱剂体积分数. 为了确定洗脱液的用量，取一定量微囊藻毒素 初级粉末复溶后吸附到树脂柱上，采用最佳体积分 数的甲醇水溶液进行洗脱，用 10 mL 量筒收集流出 的洗脱液，每流出 10 mL 作为一个样品，编号为 1, 2, · · · , 13，共 13 份 10 mL 样品，再把各个样品浓 缩至 1 mL，然后用 HPLC 检测浓缩后样品中微囊 藻毒素 MC-LR 的质量浓度. 将微囊藻毒素 MC-LR 质量浓度对洗脱液体积作图，得到 MC-LR 的淋洗 曲线，从而确定洗脱剂的用量. 1.3.4 大孔树脂纯化方法建立 取 5 g 树脂湿法装柱，微囊藻毒素初级粗品复 溶后吸附于树脂，比较分别使用不同用量的乙酸乙 酯 (由于乙酸乙酯与水混溶比例较低，所以直接使 用乙酸乙酯) 淋洗，高效液相色谱实时监测淋洗液 中微囊藻毒素 MC-LR，检测到微囊藻毒素 MC-LR 色谱峰出现时停止淋洗，记录乙酸乙酯最大用量， 并用体积分数为 60%的甲醇溶液洗脱树脂上的微囊 藻毒素，将溶有微囊藻毒素的甲醇溶液旋转蒸发浓 缩至 20 mL，采用高效液相色谱法测定微囊藻毒素 MC-LR 的质量浓度，计算获得产品中微囊藻毒素 MC-LR 质量占原始粗品中微囊藻毒素 MC-LR 质 量之比 (回收率)，同时通过微囊藻毒素粗品和经过

·1258 北京科技大学学报 第35卷 乙酸乙酯淋洗去除杂质纯化后产品的色谱图，分析 四个是微囊藻毒素MCLR的组分峰.由于前三个 杂质去除情况 峰的峰面积和比微囊藻毒素MC-LR的组分峰峰面 用同样方法比较不同体积分数的乙醇溶液、乙 积大很多，说明微囊藻毒素初级粗品粉末中杂质含 酸溶液和丙酮溶液淋洗杂质的效果，选择各种淋洗 量依然很高，微囊藻毒素MC-LR纯度较低，有待 剂的最佳体积分数，确定其最大用量 于进一步纯化 用以上方法确定XAD-2树脂的淋洗剂种类、体 600 积分数及用量后，确定XAD-2树脂的最佳淋洗条 500 件 400 再用同样方法确定D101树脂的淋洗剂种类、 兰300 体积分数及用量. 200 最后比较两种树脂在各自最佳淋洗条件下的 100 MC-LR 纯化效果，从而确定最佳树脂并建立固相吸附分离 纯化体系.大孔树脂提取藻粉粗品纯化体系的建立 0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.5 时间/min 方案见图2 图3微囊藻毒素初级粗品粉末色谱图 XAD2 y 乙酸乙酯 分别 树脂 选择 乙酸 最佳 择 Fig.3 Chromatogram of MC-LR primary crude powder 藻粉 纯 粗品 体积 D101 乙醇 分数 树 体 2.1.2微囊藻毒素粗品粉末均匀性检验 树脂 和用 丙酮 量 脂 系 由于藻粉粗品粉末将用于替代微囊藻毒素标 准品进行纯化方法研究，其均匀性对于实验结果影 图2 大孔树脂提取藻粉粗品纯化体系建立方案 响很大，所以必须对藻粉粗品均匀性进行检验.按 Fig.2 Building program of the purification system of MC 照1.3.2的均匀性检测方法，获得检测结果于表1. LR by macroporous resin 由表1数据可以看出，16个藻粉粗品样品点的微 1.3.5微囊藻毒素回收率计算 囊藻毒素MC-LR平均含量在0.21~0.24mgg-1之 CV 间，总平均值为0.23mgg1,样品间的相对标准偏 R=106mw (1) 差为3%，可见由本文实验方法获得的粉末均匀性 式中：R为回收率：C为洗脱液中微囊藻毒素MC 良好，可以为下一步的实验提供组分均匀的原料 LR的质量浓度，gmL-1:V为洗脱液体积，mL:m 2.2洗脱剂的浓度及体积的选择 为微囊藻毒素粗品粉末质量，g:w为微囊藻毒素粗 当藻粉粗品经过杂质淋洗后，需要用洗脱剂将 品粉末中微囊藻毒素MC-LR的质量分数。 其从树脂上洗脱下来.按照1.3.3的方法比较了体 1.3.6色谱条件 积分数30%、50%、60%、70%和90%的甲醇水溶液 inerteil ODS-3色谱柱(416mm×250mm,5 对天然藻粉中微囊藻毒素MC-LR的提取效果，实 um):柱温：25℃；流动相体积比：V(体积分数 验结果见图4.从图4可以看出，体积分数为60%的 0.1%的三氟乙酸TFA水溶液)：V(甲醇)=60：40：流 甲醇水溶液对藻粉中微囊藻毒素MC-LR具有最强 速：1.0 mL.min-1:进样量：20L;检测波长为239 提取能力，因此选用60%甲醇水溶液对吸附在大孔 nm. 树脂上的微囊藻毒素MC-LR进行洗脱，天然藻粉 2结果与讨论 中微囊藻毒素MC-LR的萃取剂同样选用60%甲醇 2.1微囊藻毒素粗品纯度及均匀性检测 水溶液. 2.1.1微囊藻毒素粗品纯度分析 同时按照1.3.3的方法采用60%甲醇溶液对吸 本文以萃取天然藻粉获得的微囊藻毒素初级粗 附在XAD-2树脂及D101树脂上的微囊藻毒素MC 品粉末作为研究对象.按照1.3.1的实验方法处理藻 LR进行洗脱，制作淋洗曲线，结果见图5.从图5 粉498.6774g获得微囊藻毒素初级粗品粉末33.3912 的淋洗曲线可以看出，对于XAD-2树脂，淋洗体积 g,其中MC-LR质量分数0.023%.图3为所得微囊 为30mL时洗脱液中才有树脂上吸附的微囊藻毒 藻毒素初级粗品粉末色谱图，从图3可以看出，初 素MC-LR检出：淋洗体积为6OmL时洗脱液中检 级粗品主要有四个峰，其中前三个峰属于杂质，第 出MC-LR浓度达到最大值；淋洗体积为120mL时

· 1258 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 35 卷 乙酸乙酯淋洗去除杂质纯化后产品的色谱图，分析 杂质去除情况. 用同样方法比较不同体积分数的乙醇溶液、乙 酸溶液和丙酮溶液淋洗杂质的效果，选择各种淋洗 剂的最佳体积分数，确定其最大用量. 用以上方法确定 XAD-2 树脂的淋洗剂种类、体 积分数及用量后，确定 XAD-2 树脂的最佳淋洗条 件. 再用同样方法确定 D101 树脂的淋洗剂种类、 体积分数及用量. 最后比较两种树脂在各自最佳淋洗条件下的 纯化效果，从而确定最佳树脂并建立固相吸附分离 纯化体系. 大孔树脂提取藻粉粗品纯化体系的建立 方案见图 2. 图 2 大孔树脂提取藻粉粗品纯化体系建立方案 Fig.2 Building program of the purification system of MC￾LR by macroporous resin 1.3.5 微囊藻毒素回收率计算 R = CV 106mw . (1) 式中：R 为回收率；C 为洗脱液中微囊藻毒素 MC￾LR 的质量浓度，µg·mL−1；V 为洗脱液体积，mL；m 为微囊藻毒素粗品粉末质量，g；w 为微囊藻毒素粗 品粉末中微囊藻毒素 MC-LR 的质量分数。 1.3.6 色谱条件 Inerteil ODS-3 色谱柱 (416 mm×250 mm, 5 µm)；柱温：25 ℃；流动相体积比：V (体积分数 0.1%的三氟乙酸TFA 水溶液):V (甲醇)=60:40； 流 速：1.0 mL·min−1；进样量：20 µL；检测波长为 239 nm. 2 结果与讨论 2.1 微囊藻毒素粗品纯度及均匀性检测 2.1.1 微囊藻毒素粗品纯度分析 本文以萃取天然藻粉获得的微囊藻毒素初级粗 品粉末作为研究对象. 按照 1.3.1 的实验方法处理藻 粉 498.6774 g 获得微囊藻毒素初级粗品粉末 33.3912 g，其中 MC-LR 质量分数 0.023%. 图 3 为所得微囊 藻毒素初级粗品粉末色谱图，从图 3 可以看出，初 级粗品主要有四个峰，其中前三个峰属于杂质，第 四个是微囊藻毒素 MC-LR 的组分峰. 由于前三个 峰的峰面积和比微囊藻毒素 MC-LR 的组分峰峰面 积大很多，说明微囊藻毒素初级粗品粉末中杂质含 量依然很高，微囊藻毒素 MC-LR 纯度较低，有待 于进一步纯化. 图 3 微囊藻毒素初级粗品粉末色谱图 Fig.3 Chromatogram of MC-LR primary crude powder 2.1.2 微囊藻毒素粗品粉末均匀性检验 由于藻粉粗品粉末将用于替代微囊藻毒素标 准品进行纯化方法研究，其均匀性对于实验结果影 响很大，所以必须对藻粉粗品均匀性进行检验. 按 照 1.3.2 的均匀性检测方法，获得检测结果于表 1. 由表 1 数据可以看出，16 个藻粉粗品样品点的微 囊藻毒素 MC-LR 平均含量在 0.21 ∼0.24 mg·g −1 之 间，总平均值为 0.23 mg·g −1，样品间的相对标准偏 差为 3%，可见由本文实验方法获得的粉末均匀性 良好，可以为下一步的实验提供组分均匀的原料. 2.2 洗脱剂的浓度及体积的选择 当藻粉粗品经过杂质淋洗后，需要用洗脱剂将 其从树脂上洗脱下来. 按照 1.3.3 的方法比较了体 积分数 30%、50%、60%、70%和 90 %的甲醇水溶液 对天然藻粉中微囊藻毒素 MC-LR 的提取效果，实 验结果见图 4. 从图 4 可以看出，体积分数为 60%的 甲醇水溶液对藻粉中微囊藻毒素 MC-LR 具有最强 提取能力，因此选用 60%甲醇水溶液对吸附在大孔 树脂上的微囊藻毒素 MC-LR 进行洗脱, 天然藻粉 中微囊藻毒素 MC-LR 的萃取剂同样选用 60%甲醇 水溶液. 同时按照 1.3.3 的方法采用 60%甲醇溶液对吸 附在 XAD-2 树脂及 D101 树脂上的微囊藻毒素 MC￾LR 进行洗脱，制作淋洗曲线，结果见图 5. 从图 5 的淋洗曲线可以看出，对于 XAD-2 树脂，淋洗体积 为 30 mL 时洗脱液中才有树脂上吸附的微囊藻毒 素 MC-LR 检出；淋洗体积为 60 mL 时洗脱液中检 出 MC-LR 浓度达到最大值；淋洗体积为 120 mL 时

第10期 曹艳秋等：大孔吸附树脂从藻粉中分离纯化微囊藻毒素 ·1259· 表1MC-LR初级粗品粉末均匀性检测结果 Table 1 Content uniformity test results of MC-LR primary crude powder 取点 含量/(mgg-1) 实验1 相对标准偏差，RSD/% 实验2 实验3 均值 # 0.23 0.22 0.24 0.23 2# 0.21 0.22 0.23 0.22 3# 0.24 0.23 0.23 0.23 4# 0.20 0.24 0.22 0.22 5# 0.21 0.23 0.22 0.22 6# 0.19 0.21 0.22 0.21 7# 0.23 0.24 0.21 0.23 8# 0.22 0.23 0.24 0.23 9# 0.20 0.23 0.23 0.22 10# 0.23 0.24 0.21 0.23 11# 0.22 0.25 0.24 0.24 12# 0.23 0.22 0.25 0.23 13# 0.24 0.23 0.22 0.23 14# 0.21 0.23 0.23 0.22 15# 0.24 0.22 0.23 0.23 16# 0.21 0.23 0.23 0.22 均值 0.23 3.0 5.0 大于120mL.为确保淋洗完全，洗脱剂用量定为150 mL.对于D101树脂，淋洗体积为20mL时就可以 0 在洗脱液中检出吸附在树脂上的微囊藻毒素MC LR:淋洗体积为50mL时洗脱液中检出的MC LR浓度达到最大值：淋洗体积为100mL时，洗 3.0 脱液中不再有MC-LR检出，说明此时树脂上所有 MCLR已经被淋洗下来，因此洗脱剂用量应该大 于100mL.为确保淋洗完全，洗脱剂用量定为120 2. 20 40 60 80 100 mL.比较图5中两条淋洗曲线可以发现D101树 甲醇体积分数/% 脂对微囊藻毒素MC-LR的吸附能力不及XAD-2 图4 甲醇体积分数对洗脱液MCLR质量浓度的影响 树脂 Fig.4 Effect of methanol volume fraction on the mass con- 2.3杂质淋洗剂的选择 centration of MC-LR in the eluent 分别取体积分数为20%、30%、40%和45%的 0 乙酸溶液，15%、20%、25%、30%和40%的乙醇溶 ◆XAD-2 新050 ●D101 液以及10%、15%、20%、25%和30%丙酮溶液对吸 附有微囊藻毒素的XAD-2树脂及D101树脂进行 杂质淋洗，实时监测柱上流出的杂质淋洗液中是否 含有微囊藻毒素，检测到微囊藻毒素时说明有藻毒 1510 素随杂质洗下，此时停止淋洗，记录消耗淋洗剂体 积，同时洗脱柱上微囊藻毒素并检测其回收率，采 用三种溶液得到的淋洗杂质效果图分别如图6~图 0 20 406080100120140 8所示.从图6可以看出，对于两种树脂来说，当采 淋洗体积/ml 用体积分数为40%的乙酸溶液进行杂质淋洗后，微 图5淋洗次数对洗脱液中MC-LR浓度的影响 囊藻毒素具有最高的回收率.从图7可以看出，对 Fig.5 Effects of elution times on the concentration of MC- 于两种树脂来说，当采用体积分数为20%的乙醇溶 LR in the eluent 液进行杂质淋洗后，微囊藻毒素具有最高的回收率 洗脱液中MC-LR不再被检出，说明此时树脂上所 从图8可以看出，当采用体积分数为10%的丙酮溶 有MC-LR已经被淋洗下来，因此洗脱剂用量应该 液进行杂质淋洗后，微囊藻毒素具有最高的回收率

第 10 期 曹艳秋等：大孔吸附树脂从藻粉中分离纯化微囊藻毒素 1259 ·· 表 1 MC-LR 初级粗品粉末均匀性检测结果 Table 1 Content uniformity test results of MC-LR primary crude powder 取点 含量/(mg·g−1 ) 相对标准偏差，RSD/% 实验 1 实验 2 实验 3 均值 1# 0.23 0.22 0.24 0.23 2# 0.21 0.22 0.23 0.22 3# 0.24 0.23 0.23 0.23 4# 0.20 0.24 0.22 0.22 5# 0.21 0.23 0.22 0.22 6# 0.19 0.21 0.22 0.21 7# 0.23 0.24 0.21 0.23 8# 0.22 0.23 0.24 0.23 9# 0.20 0.23 0.23 0.22 10# 0.23 0.24 0.21 0.23 11# 0.22 0.25 0.24 0.24 12# 0.23 0.22 0.25 0.23 13# 0.24 0.23 0.22 0.23 14# 0.21 0.23 0.23 0.22 15# 0.24 0.22 0.23 0.23 16# 0.21 0.23 0.23 0.22 均值 0.23 3.0 图 4 甲醇体积分数对洗脱液 MC-LR 质量浓度的影响 Fig.4 Effect of methanol volume fraction on the mass con￾centration of MC-LR in the eluent 图 5 淋洗次数对洗脱液中 MC-LR 浓度的影响 Fig.5 Effects of elution times on the concentration of MC￾LR in the eluent 洗脱液中 MC-LR 不再被检出，说明此时树脂上所 有 MC-LR 已经被淋洗下来，因此洗脱剂用量应该 大于 120 mL. 为确保淋洗完全，洗脱剂用量定为 150 mL.对于 D101 树脂，淋洗体积为 20 mL 时就可以 在洗脱液中检出吸附在树脂上的微囊藻毒素 MC￾LR；淋洗体积为 50 mL 时洗脱液中检出的 MC￾LR 浓度达到最大值；淋洗体积为 100 mL 时，洗 脱液中不再有 MC-LR 检出，说明此时树脂上所有 MC-LR 已经被淋洗下来，因此洗脱剂用量应该大 于 100mL.为确保淋洗完全，洗脱剂用量定为 120 mL. 比较图 5 中两条淋洗曲线可以发现 D101 树 脂对微囊藻毒素 MC-LR 的吸附能力不及 XAD-2 树脂. 2.3 杂质淋洗剂的选择 分别取体积分数为 20%、30%、40%和 45%的 乙酸溶液，15%、20%、25%、30%和 40%的乙醇溶 液以及 10%、15%、20%、25%和 30%丙酮溶液对吸 附有微囊藻毒素的 XAD-2 树脂及 D101 树脂进行 杂质淋洗，实时监测柱上流出的杂质淋洗液中是否 含有微囊藻毒素，检测到微囊藻毒素时说明有藻毒 素随杂质洗下，此时停止淋洗，记录消耗淋洗剂体 积，同时洗脱柱上微囊藻毒素并检测其回收率，采 用三种溶液得到的淋洗杂质效果图分别如图 6∼ 图 8 所示. 从图 6 可以看出，对于两种树脂来说，当采 用体积分数为 40%的乙酸溶液进行杂质淋洗后，微 囊藻毒素具有最高的回收率. 从图 7 可以看出，对 于两种树脂来说，当采用体积分数为 20%的乙醇溶 液进行杂质淋洗后，微囊藻毒素具有最高的回收率. 从图 8 可以看出，当采用体积分数为 10%的丙酮溶 液进行杂质淋洗后，微囊藻毒素具有最高的回收率

·1260 北京科技大学学报 第35卷 5 ◆XAD-2 质，60%甲醇水溶液洗脱微囊藻毒素MC-LR)和 ●D101 40 D101树脂分离体系(D101树脂固相吸附，40%乙 酸、20%乙醇和10%丙酮淋洗杂质，60%甲醇水溶液 35 洗脱微囊藻毒素MC-LR)淋洗纯化微囊藻毒素粗品 中微囊藻毒素MC-LR,获得洗脱液色谱图如图9和 30 图10所示.比较图9和图10可以看出XAD-2树 25 脂分离体系纯化藻粉粗品后获得产品比同样条件下 D101树脂分离体系得到的产品杂质更少些. 20 10 30 6 50 20 乙酸体积分数/% 图6 乙酸含量对MC-LR回收率的影响 10 MC-LR Fig.6 Effects of acetic acid content on the recovery of MC. LR 50 ◆XAD-2 ◆D101 45 -10 0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.5 40 时间/min 图9藻粉粗品经XAD-2树脂分离体系纯化后洗脱液中 MC-LR色谱 30 Fig.9 Chromatogram of MC-LR in the eluent when the crude algae powder was purified by the XAD-2 resin sepa- 10 15 20 25 30 35 40 ration system 乙醇休积分数/% 20 图7乙醇含量对MC-LR回收率的影响 Fig.7 Effects of ethanol content on the recovery of MC-LR 90 ◆XAD-2 15 80 ◆D101 70 5 MC-LR 60 50 0- 5.0 7.510.012.515.017.520.022.5 40 时间/min 0 图10 藻粉粗品经D101树脂纯化后洗脱液中MC-LR色谱 2 5 1520 25 30 Fg.10 Chromatogram of MC-LR in the eluent when the 丙酮体积分数/% crude algae powder was purified by D101 resin separation sys- 图8丙酮含量对MC-LR回收率的影响 tem Fig.8 Effects of acetone content on the recovery of MC-LR 用高效液相色谱分析两种分离体系获得的含 因此，对于采用XAD2树脂及D101树脂进行杂 有微囊藻毒素的溶液中微囊藻毒素的含量，从而计 质分离纯化粗品中微囊藻毒素MCLR时，采用各 算出获得的含有微囊藻毒素的溶液中微囊藻毒素的 淋洗剂的最佳含量定为40%乙酸、20%乙醇和10% 质量，再根据处理的微囊藻毒素粗品中微囊藻毒素 丙酮. 的质量计算微囊藻毒素回收率，分别使用XAD-2树 2.4树脂的选择 脂体系和D101树脂体系的条件对微囊藻毒素初级 分别使用XAD-2树脂分离体系(XAD-2树脂 粗品进行纯化实验，获得结果见表2.从表2数据 固相吸附，40%乙酸、20%乙醇和10%丙酮淋洗杂 可以看出，经XAD2树脂法分离体系纯化获得的产

· 1260 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 35 卷 图 6 乙酸含量对 MC-LR 回收率的影响 Fig.6 Effects of acetic acid content on the recovery of MC￾LR 图 7 乙醇含量对 MC-LR 回收率的影响 Fig.7 Effects of ethanol content on the recovery of MC-LR 图 8 丙酮含量对 MC-LR 回收率的影响 Fig.8 Effects of acetone content on the recovery of MC-LR 因此，对于采用 XAD2 树脂及 D101 树脂进行杂 质分离纯化粗品中微囊藻毒素 MC-LR 时，采用各 淋洗剂的最佳含量定为 40%乙酸、20%乙醇和 10% 丙酮. 2.4 树脂的选择 分别使用 XAD-2 树脂分离体系 (XAD-2 树脂 固相吸附，40%乙酸、20%乙醇和 10%丙酮淋洗杂 质，60%甲醇水溶液洗脱微囊藻毒素 MC-LR) 和 D101 树脂分离体系 (D101 树脂固相吸附，40%乙 酸、20%乙醇和 10%丙酮淋洗杂质，60%甲醇水溶液 洗脱微囊藻毒素 MC-LR) 淋洗纯化微囊藻毒素粗品 中微囊藻毒素 MC-LR，获得洗脱液色谱图如图 9 和 图 10 所示. 比较图 9 和图 10 可以看出 XAD-2 树 脂分离体系纯化藻粉粗品后获得产品比同样条件下 D101 树脂分离体系得到的产品杂质更少些. 图 9 藻粉粗品经 XAD-2 树脂分离体系纯化后洗脱液中 MC-LR 色谱 Fig.9 Chromatogram of MC-LR in the eluent when the crude algae powder was purified by the XAD-2 resin sepa￾ration system 图 10 藻粉粗品经 D101 树脂纯化后洗脱液中 MC-LR 色谱 Fig.10 Chromatogram of MC-LR in the eluent when the crude algae powder was purified by D101 resin separation sys￾tem 用高效液相色谱分析两种分离体系获得的含 有微囊藻毒素的溶液中微囊藻毒素的含量，从而计 算出获得的含有微囊藻毒素的溶液中微囊藻毒素的 质量，再根据处理的微囊藻毒素粗品中微囊藻毒素 的质量计算微囊藻毒素回收率，分别使用 XAD-2 树 脂体系和 D101 树脂体系的条件对微囊藻毒素初级 粗品进行纯化实验，获得结果见表 2. 从表 2 数据 可以看出，经 XAD2 树脂法分离体系纯化获得的产