夏孢子堆，制片。用纱布将刮刀擦干净再刮取虚线形、黑色冬孢子堆，制 片，分别镜检。夏孢子单生，卵圆形、橘黄色，表面有微刺：冬孢子深褐 色，双胞，有短柄。 4.梨锈病(Gymnosporangium asiaticum):观察梨胶锈病害标本。梨锈病生活 史上产生四种不同的孢子，性孢子和锈孢子产生梨树上：冬孢子则产生在 转主寄主桧柏上。冬孢子堆埋在细枝条表皮下，突出表皮呈角状，遇水胶 化，近黄色或深褐色。将冬孢子角挑下，浸泡在水里，室温下存放24小时， 挑取黄色胶状物少许制片，观察冬孢子形态，以及冬孢子萌发产生的担子 和担孢子。 五、作业 1.绘出小麦条锈病、小麦秆黑粉病的病原菌形态图。 2.从病害的症状以及病原菌形态特点上说明小麦散黑穗病、小麦腥黑穗病、 小麦秆黑粉病和小麦黑粉病的区别？ 3.米瘤黑粉病、小麦散黑穗病和小麦网腥黑穗病的病原菌的冬孢子萌发后，各 有什么特点？ 4.试述我国小麦条锈病和梨锈病在周年循环中有什么不同？
实验六植物病原细菌的一般形态观察和染色 一、目的要求 1.观察几种重要病原细菌的形态及菌落形态特征。 2.学习细菌的简单染色法。 3.了解革兰氏染色法的原理，掌握节兰氏染色法以鉴别细菌。 二、基本原理 细菌个体小而透明，活细胞与水及玻璃的折光率相差无几，在普通光学显微镜 下难以看清。若经染料染色后，增强了细胞折光性，借助颜色的反衬作用，就能看 清它们的形状、大小和排列方式。 细菌细胞含核酸较多，故一般染色多用碱性染料，如碱性复红(Basic fuchsin) 美蓝(Methylene blu))、结晶紫(Crystal vioe)、孔雀绿Malachitr、番红 (Safranine O)等，染料需预先配成染液供使用。草兰氏染色法是细菌学中一种重要的 鉴别染色法。其方法是，细菌涂片先经结品紫初染，加媒染剂碘液处理，再以脱色 剂酒精脱色，最后用复染剂番红复染。若细菌不被脱色而保留紫红色者，称为革兰 氏阳性菌或正反应(G表示)：若被脱色而染上复染剂的粉红色者，则被称为革兰氏 阴性菌或负反应(G表示)。革兰氏染色常受到菌龄、培养基的PH值和染色技术等 的影响，一般采用低龄菌为宜 革兰氏染色机理与两类细菌的细胞壁成分和结构有密切关系。革兰氏阴性菌的 细胞壁中含较多的类脂质，而肽聚糖含量较少，当用酒精脱色时，类脂质被溶解， 从而增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫与碘的复合物易于渗出，结果细胞 被脱色，经复染后则呈现出复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量 多而且交联度大，类脂质含量少，经酒精脱色时，肽聚糖层的孔径变小，通透性降 低，因而细胞仍保留初染时的颜色 植物病原细菌的五个主要属，除棒状杆菌属(Corynebacterium)外，其它均为 革兰氏阴性菌。 (一)细菌的简单染色法 一、实验材料 1.菌种培养18~24小时的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆 菌(Bac.megathrium)、或培养48小时的四联微球菌(Micrococcus tetragens)、人金色微球菌(Micrococcu arurueus)。 2.器材石炭酸复红液或美蓝染色液，结品紫染液，番红染色液，蒸馏 水，载玻片，接种环，酒精灯，火柴，洗瓶，染色盆，废液缸，吸水纸
擦镜纸，显微镜，双层瓶。 二、实验步骤 制作细菌玻片的步骤：涂片→干燥→加热固定→冷却→染色→水洗→干燥一 镜检 1.涂片取干净载玻片一张防于染色架上。在载玻片两处分别滴加蒸馏水一滴， 以无菌操作法用接种环取斜面菌种菌体少许，放于载玻片上一处的水滴中混 匀，并涂成均匀的薄层；另一滴水同法放入第二种菌体涂匀。 2.干燥使涂片在空气中自然风干或在酒精灯焰上8~10厘米处微热烘干。 3.加热固定将干燥后的涂片用手拿住一端（涂面向上），以钟摆摆动速度通 过灯焰2~3次，使加热固定。目的是杀死细胞以增强细胞着色能力，并使细 胞黏着于载玻片上。 4,染色将载玻片放回染色架上，冷却后，任取染色液一种，滴1~2滴于载玻 片进行染色。一般碱性复红染色3060秒，美蓝染色2~3分钟，结晶紫染色 1分钟，番红染色23分钟。 5.水洗染色完毕，手持染色架略呈倾斜状，用洗瓶从载玻片一端缓慢冲洗染 液，废液收集在废液缸中。再用吸水纸吸去载玻片上残留水滴，自然干燥。 6.镜检先用低倍镜寻找标本部位，再换高倍镜、油镜观察。 (二)细菌的革兰氏染色法 一、实验材料 1.菌种培养24小时的大肠杆茵(E.coli)和金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 2.器材结晶紫染色液，路哥氏(Lug01)碘液，95%酒精，番红或石炭酸复红染 色液，载玻片，接种环，酒精灯及其它染色、镜检用物。 二、实验步骤 革兰氏染色的程序为：涂片→干燥→加热固定→冷却→结品紫初染（水洗）→碘 液媒染（水洗）→洒精脱色（水洗）→番红复染（水洗）→干燥→镜检。 1.涂片、固定：取干净载玻片一张放在染色架上分别在载玻片的两处，各滴一滴蒸 馏水，按无菌操作法用接种环分别取大肠杆菌与金色葡萄球菌少许，各涂于载 玻片上的水滴中（作好标记），涂匀，干燥，加热固定。 2.染色：待涂片冷却后染色。先滴加结品紫染色1分钟，用水冲去染液，控净水， 再滴加碘液媒染1分钟，倾去碘液，水冲洗后。以95%的酒精脱色2030秒（严 格掌握时间)，水洗，最后滴加番红复染2~3分钟（或用石炭酸复红复染30秒）， 水洗后，干燥。 3.镜检：先用低倍镜寻找标本部位，再换高倍镜、油镜观察
(三)植物病原细菌菌落观察 一、实验材料 病原细菌平板培养物： Xanthomonas oryzae, Pseudomonas solanacearum, Erwinia carotovora var.carotovora. Corynebacterium sepedonicum, Agrobacterium tumefaciens. 二、菌落形态观察 1.Xanthomonas:以X.oryzae为例，菌落蜜黄色，圆形，中央隆起，边缘整齐，质 地均匀。 2.Pseudomonas:以Psolanacearum为例，菌落灰白色，较光滑，湿润、隆起，有 时亦粗燥，干架而平楼。 3.Erwinias:以E.carotovora varcarotovora为例，菌落乳白色，圆形或变形虫形， 半透明而有光泽。 4.Corynebacterium:以C.sepedonicum为例，菌落乳白色或淡黄色，圆形，边缘整 齐，不透明，有光泽。 5.Agrobacterium:以A.Tumefaciens为例，菌落白色，圆形，边缘整齐，表面光滑。 半透明。 三、作业 1.记述所观察的细菌的形态 2.简单染色的原理和步骤是什么？ 3.革兰氏染色法为何要求用低龄细南进行观察？
实验七植物病毒的一般形态电镜观察 一、目的要求 1.了解植物病原病毒的一般形态特征。 2.病毒的电镜观察 二、基本原理 病毒是一种由核酸和蛋白外壳组成的具有侵染活性的细胞内寄生物。植物病南 的形态大小是植物病毒鉴定和分类的依据之一，任何完整的成熟的病毒颗粒，都具 有固定的形态。病毒粒子大小一般为20-70m之间，主要有杆状、线状、球状或近 球状、杆南伏或弹状和联体病毒 利用电镜技术观察植物病毒颗粒是进行病毒鉴定和分类最直接的方法之一。这 种方法是将提纯的病毒样品或病汁液，直接滴加在有支持膜的铜网上，并用对电子 散射力强的重金属染液负染，进行透射电镜观察。这样负染液中的重金属粒子将样 品包围起来，使样品周围的背景加深，在暗的背景上显示出样品的精细结构，增加 被包围样品的反差，提高电镜的分辨率。 三、实验材料 提纯的TMV、CMV,TMV的病叶，磷酸缓冲液(PH=8.0),2-4%的醋 酸双氧铀(PH7.2),蒸馏水，400目铜网，滤纸，镊子，透射电镜等。 四、实验步骤 取病毒提纯液或病汁液一滴，直接滴在铺有支持膜的铜网上，在室温下吸 附5分钟，用滤纸吸干，再加2%的醋酸双氧铀负染4分钟，然后吸取多余液体， 用蒸馏水滴洗10滴，干燥后置电镜下观察。测量病毒粒子的大小。 观察时注意病毒粒子的形态、大小，核酸芯和蛋白外壳有无。 病毒粒子实际大小=电镜视野下粒子大小(m) 放大倍数 五、作业 描述你所观察到的病毒粒子形态大小