PoyA信号序列:保持mRNA的稳定性,防止降解,保证 了转录产物的加工和正确性,但序列不宜太长,避免能量 过度消耗。添加PoyA信号和5端转录暂停位点,可以减 上游序列转录通读造成的背景。 牛生长素(BGH)基因的PoA信号比sV40PoyA更强, 常用于高效表达载体中。 终止序列: AAUAAA或连续的终止密码UGA、UAA和 UAG,能防止转录通读,使转录在正确的位点结束 在转录起始点上游或下游使用相同类型的增强子,有利于 提高外源基因的转录水平
PolyA信号序列：保持mRNA的稳定性，防止降解，保证 了转录产物的加工和正确性，但序列不宜太长，避免能量 过度消耗。添加PolyA信号和5′端转录暂停位点，可以减 少上游序列转录通读造成的背景。 牛生长素（BGH）基因的PolyA信号比SV40 PolyA更强， 常用于高效表达载体中。 终止序列：AAUAAA或连续的终止密码UGA、UAA和 UAG，能防止转录通读，使转录在正确的位点结束。 在转录起始点上游或下游使用相同类型的增强子，有利于 提高外源基因的转录水平
双顺反子表达载体: 两个基因在同一启动子控制之下,内部核糖体进入位点 使同一mRNA中的第二个基因得到翻译。将f与目标 基因串连,f的cDNA插入内含子中,其转录产物被剪 切,翻译不出蛋白质,而目标基因的转录产物得到翻译。 顺反子在多亚基蛋白的偶联表达及其控制策略等方面有 广泛应用前景。 使筛选容易,而且能高效表达
双顺反子表达载体： 两个基因在同一启动子控制之下，内部核糖体进入位点 使同一mRNA中的第二个基因得到翻译。将dhfr与目标 基因串连，dhfr的cDNA插入内含子中，其转录产物被剪 切，翻译不出蛋白质，而目标基因的转录产物得到翻译。 顺反子在多亚基蛋白的偶联表达及其控制策略等方面有 广泛应用前景。 使筛选容易，而且能高效表达
选择适宜的启动子,可实现定向表达。 CMV启动子和人EF-1a启动子,可实现同一载体上的二个 基因的独立表达。 组织特异性启动子:如鼠、山羊酪蛋白启动子,可使基因 主要在乳腺中表达。 N端设计分泌信号肽:如Igk链的可变区和恒定区之间序 列,使外源基因的表达产物向胞外分泌。 C端设计跨膜锚定序列:可使外源蛋白展示在细胞表面。 亚细胞定位信号肽:目标基因产物将转运到细胞核、线粒 体、内质网或细胞质中,这对基因的功能研究非常合适
选择适宜的启动子，可实现定向表达。 CMV启动子和人EF-1α启动子，可实现同一载体上的二个 基因的独立表达。 组织特异性启动子：如鼠、山羊酪蛋白启动子，可使基因 主要在乳腺中表达。 N端设计分泌信号肽：如Ig κ链的可变区和恒定区之间序 列，使外源基因的表达产物向胞外分泌。 C端设计跨膜锚定序列：可使外源蛋白展示在细胞表面。 亚细胞定位信号肽：目标基因产物将转运到细胞核、线粒 体、内质网或细胞质中，这对基因的功能研究非常合适
基因的扩增系统: 在逐渐提高选择压的情况下,使选择标记基因拷贝数增 加,并可连带其两侧序列一起扩增,从而提高表达基因 水平。 最常用二氢叶酸二氢叶酸还原酶(DHFR)基因系统和 谷氨酰氨合成酶(GS)基因系统。 氨甲喋呤基因与目标基因重组,氨甲喋呤使∫基因与 目标基因大量增加,达到数千拷贝。 硫胺蛋氨酸使GS系统的基因得到大量扩增
基因的扩增系统： 在逐渐提高选择压的情况下，使选择标记基因拷贝数增 加，并可连带其两侧序列一起扩增，从而提高表达基因 水平。 最常用二氢叶酸二氢叶酸还原酶（DHFR）基因系统和 谷氨酰氨合成酶（GS）基因系统。 氨甲喋呤基因与目标基因重组，氨甲喋呤使dhfr基因与 目标基因大量增加，达到数千拷贝。 硫胺蛋氨酸使GS系统的基因得到大量扩增
受体细胞 1.人源细胞株系 Namalwa:类淋巴母细胞,非整体核型。表达IgM,悬浮 生长。外源基因的表达水平较高,可用无血清培养基高密 度培养,已成功地表达了 rhEPO、rhG-CSF、tPA等。英 国 Wellcome公司用 Namalwa细胞的反应器达800L,用 Sendai病毒诱导,大规模生产a干扰素,并批准上市。 WI-38:二倍体成纤维细胞系,2n=46,第一个被用于制 备疫苗。贴壁生长,对很多病毒敏感,广泛用于疫苗生产 MRC5:二倍体成纤维细胞系,但生长较W38快,对逆 境有一定抗性也用于制备疫苗
二、受体细胞 1．人源细胞株系 Namalwa：类淋巴母细胞，非整体核型。表达IgM，悬浮 生长。外源基因的表达水平较高，可用无血清培养基高密 度培养，已成功地表达了rhEPO、rhG-CSF、tPA等。英 国Wellcome公司用Namalwa细胞的反应器达8000L，用 Sendai病毒诱导，大规模生产α干扰素，并批准上市。 WI-38：二倍体成纤维细胞系，2n=46，第一个被用于制 备疫苗。贴壁生长，对很多病毒敏感，广泛用于疫苗生产。 MRC-5：二倍体成纤维细胞系，但生长较WI-38快，对逆 境有一定抗性也用于制备疫苗