缺点: 1)重组率低,筛选困难,周期长,需要4-10天 2)外源基因的表达在转染的晚期,大约在20h后起始基因 表达,在72-94h细胞裂解死亡,基因表达时间约30 50h,高水平表达不连续且时间短,这对表达不利。 3)昆虫细胞糖基化等加工途径与哺乳动物细胞不完全相 同,它不提供复杂的N糖基化,如添加半乳糖和唾液酸残 基,有可能造成溶解性、稳定性、免疫性等变化。表达水 平非常高,加工装备跟不上,蛋白质修饰效率可能不高。 研究开发的主要方向:有效的病毒表达载体; 决定基因表达时期启动子,无血清培养昆虫细胞系
缺点： 1）重组率低，筛选困难，周期长，需要4－10天。 2）外源基因的表达在转染的晚期，大约在20h后起始基因 表达，在72－94h细胞裂解死亡，基因表达时间约30－ 50h，高水平表达不连续且时间短，这对表达不利。 3）昆虫细胞糖基化等加工途径与哺乳动物细胞不完全相 同，它不提供复杂的N糖基化，如添加半乳糖和唾液酸残 基，有可能造成溶解性、稳定性、免疫性等变化。表达水 平非常高，加工装备跟不上，蛋白质修饰效率可能不高。 研究开发的主要方向：有效的病毒表达载体； 决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系
第二节基因工程动物细胞系的构建 构建高效表达载体 转染动物细胞 筛选鉴定 获得生产用工程化细胞系
第二节 基因工程动物细胞系的构建 构建高效表达载体 转染动物细胞 筛选鉴定 获得生产用工程化细胞系
动物细胞的表达载体:病毒载体,质粒载体。 病毒载体: 逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体,对原 始病毒改造而来 同源重组构建腺病毒载体,在静止期转染细胞,表达时间 较长 痘病毒载体可插入25~40kb外源基因,甚至是多个基因。 无感染性和致癌性,可用于构建基因工程疫苗。 美国 Genentech公司已用SV40载体生产乙肝疫苗,其他载 体可用于基因治疗
动物细胞的表达载体：病毒载体，质粒载体。 病毒载体： 逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原 始病毒改造而来。 同源重组构建腺病毒载体，在静止期转染细胞，表达时间 较长。 痘病毒载体可插入25～40 kb外源基因，甚至是多个基因。 无感染性和致癌性，可用于构建基因工程疫苗。 美国Genentech公司已用SV40载体生产乙肝疫苗，其他载 体可用于基因治疗
质粒载体: 微生物的质粒载体类似,一般是穿梭质粒,具有两个复制 子和抗性筛选标记基因。 大肠杆菌的复制子,细菌中繁殖 MCS 抗生素抗性标记,原核细胞筛选 IBGH PA 动物细胞的复制子 在宿主细胞中稳定表达。 pcDNA 还有丝状噬菌体复制子。 ColE1
质粒载体： 微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制 子和抗性筛选标记基因。 大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。 抗生素抗性标记，原核细胞筛选。 动物细胞的复制子， 在宿主细胞中稳定表达。 还有丝状噬菌体复制子
启动子序列:含有RNA聚合酶识别和结合位点,以便有 效转录。TATA盒,确定起始位置;GG盒,影响转录频 率 来源于病毒、动物基因和噬菌体的启动子。 动物病毒启动子:逆转录病毒的长末端重复序列 (LTRS)、sV40病毒的早期和晚期启动子、腺病毒的晚 期启动子、人巨噬病毒(CMV)立即早期基因启动子。 动物基因的启动子:转录因子EF-1a启动子、泛素蛋白启 动子、β-肌动蛋白启动子、干扰素-启动子、IgG启动子 鼠金属硫蛋白基因启动子等。 噬菌体T7启动子比动物基因启动子表达水平高
启动子序列：含有RNA聚合酶识别和结合位点，以便有 效转录。TATA盒，确定起始位置；GG盒，影响转录频 率。 来源于病毒、动物基因和噬菌体的启动子。 动 物 病 毒 启 动 子 ： 逆 转 录 病 毒 的 长 末 端 重 复 序 列 （LTRS）、SV40病毒的早期和晚期启动子、腺病毒的晚 期启动子、人巨噬病毒（CMV）立即早期基因启动子。 动物基因的启动子：转录因子EF-1α启动子、泛素蛋白启 动子、β-肌动蛋白启动子、干扰素-α启动子、IgG启动子、 鼠金属硫蛋白基因启动子等。 噬菌体T7启动子比动物基因启动子表达水平高