22第二章微生物的纯培养和显微技术出马中出服用新国育三一、显微镜的种类及原理一食一电1.普通光学显微镜现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜座、支架、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控，在一般情况下是固定不变的。而光学系统由物镜、目镜、聚光器等组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。一般的显微镜都可配置多种可互换的光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如明视野、暗视野、相差等。能辨别两点之间最小距离的能力被称为分辨率。对任何显微镜来说，分辨率都是决定其观察效果的最重要指标，也就是说显微镜所能达到的最小可分辨距离越小，这个显微镜的分辨率就越高。从物理学角度看，光学显微镜的最小可分辨距离或分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：0.5入最小可分辨距离：nsing式中入为所用光源波长：6为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离（图2-7）：n为玻片与物镜间介质的折射率，显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质，例如，空气（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）等。nsing也被表示为数值孔径值（numericalaperture，NA），它是决定物镜性能的最重要指标。光学显微镜在使用最短波长的可见光（入=450nm）作为光源时在油镜下可以达到其最大分辨率0.18μm（表2-1）。由于肉眼的正常分辨能力一般为0.25mm左右，因此光学显微镜有效的最高放大倍数只能达到1000~1500倍，在此基础上进一步提高显微镜的放大能力对观察效果的改善并无帮助。防中承物镜中国空理票公工作距离承载有样品的载玻片图2-7显微镜的数值孔径值与镜口角及工作距离间的关系表2-1不同显微镜物镜的特性比较物镜特性搜索物镜低倍镜高倍镜油镜放大倍数4x10x40~45x90~100×数值孔径值0.100.250.550.651.25~1.4焦深40mm16mm4mm1.8~2.0mm工作距离17~20mm4~8mm0.5~0.7mm0.1mm2.3μm0.9μm蓝光（450nm）时可以达到的分辨率0.35μm0.18μm
23第二节显微镜和显微技术聘利锁2.暗视野显微镜明视野显微镜的照明光线直接进人视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。面暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进人物镜（图2-8），因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。正如我们在白天看不到的星辰却可在黑暗的夜空中清楚地显现一样，在暗视野显微镜中由于样品与背景之间的反差增大，可以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。而且，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，依然可以通过它们散射的光而发现其存在。因此，暗视野法主要用于观察生活细菌的运动性物镜样品玻片聚光器光澜光线光线(a)(b)图2-8明视野（）与暗视野（b）的照明示意图3.相差显微镜光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变，产生相位差。人肉眼感觉不到光的相位差，但相差显微镜配备有特殊的光学装置一一环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。正由于样品的这种反差是以不同部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人们能在不染色的情况下比较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构，这是显微技术的一大突破，为此，其发明人F.Zemike获得了1953年的诺贝尔奖。4.荧光显微镜有些化合物（荧光素）可以吸收紫外线并放出一部分光波较长的可见光，这种现象称为荧光。因此，在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术24的原理。由于不同荧光素的激发波长范围不同，因此同一样品可以同时用两种以上的荧光素标记，它们在荧光显微镜下经过一定波长的光激发发射出不同颜色的光。荧光显微技术在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用十分普遍。5.透射电子显微镜人们从本世纪初开始就尝试用波长更短的电磁波取代可见光来放大成像，以制造分辨本领更高的显微镜。1933年，德国人E.Ruska制成了世界上第一台以电子束作为“光源”的显微镜一一电子显微镜。其理论依据是：电子束通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过玻璃透镜时一样，产生偏转、汇聚或发散，并同样可以聚集成像。而一束电子具有波长很短的电磁波的性质，其波长与运动速度成反比，速度越快，波长越短。在理论上，电子波的波长最短可达到0.005nm，所以儿十年来，电子显微技术发展很快，应用也日电子显微镜的分辨能力要远高于光学显微镜（图2为了表彰E.Ruska及后来发作用益广泛，对包括微生物学在内的许多学在显微技术方面所做的开拓性工作，1986年他们3人共Binning和H.明扫描隧道显微镜的G.同获得了当年的诺贝尔物理学奖。[大的原生动物DNA囍店欢商湖54文OOOOOa10mLoun100umLom100mr0.lnmtenm100nmE汽缆电：显微销图2-9各种显微镜的分辨率范围最早由E.Ruska等发明的电镜就是透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM），其工作原理和光学显微镜十分相似（图2-10）。但由于光源的不同，又决定了它与光学显微镜的一系列差
25第二节显微镜和显微技术异，主要表现在：①在电子的运行中如遇到游离的气体分子会因碰撞而发生偏转，导致物像散乱不清，因此电镜镜简中要求高真空：②电子是带电荷的粒子，因此电镜是用电磁圈来使“光线”汇聚、聚焦：③电子像人肉眼看不到，需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。电子源聚光器样品物镜中间像投影物镜一目镜用荧光屏观察成用胶片记录影像(a)(b)图2-10透射电子显微镜工作示意图（a）和照片（b）6.扫描电子显微镜扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）与光学显微镜和透射电镜不同，它的工作原理类似于电视或电传真照片。电子枪发出的电子束被磁透镜汇聚成极细的电子探针”，在样品表面进行“扫描”，电子束扫到的地方就可激发样品表面放出二次电子（同时也有一些其他信号）。二次电子产生的多少与电子束人射角度有关，也即是与样品表面的立体形貌有关。与此同时，在观察用的荧光屏上另一个电子束也做同步的扫描。二次电子由探测器收集，并在那里被闪烁器变成光信号，再经光电倍增管和放大器又变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。这样，样品上产生二次电子多的地方，在荧光屏上相应的部位就越亮，我们就能得到一幅放大的样品立体图像。扫描电镜主要被用于观察样品的表面结构。由于电子束孔径角极小，扫描电镜的景深很大，成像具有很强的立体感。与扫描电镜相比，透射电镜景深较小，一般只能观察切成薄片后的二维图像。此外，在扫描电镜中，电子束的轰击使样品表面除放出二二次电子外，还可产生许多有用的物理信号，如特征性X线谱线、阴极荧光、背散射电子、俄歇电子及样品电流等。对这些信号分别进行收集、分析，还能得到
第二章微生物的纯培养和显微技术26有关样品的其他信息。例如，收集×射线信号，可以对样品各个微区的元素组成进行分析。7.扫描隧道显微镜在光学显微镜和电子显微镜的结构和性能得到不断完善的同时，基于其他各种原理的显微镜也不断间世，使人们认识微观世界的能力和手段得到不断提高，其中20世纪80年代才出现的扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）是显微镜领域的新成员，主要原理是利用了量子力学中的隧道效应。STM有一个半径极细的金属探针，其针尖通常小到只有一个原子，可利用压电陶瓷将其推进到待测样品表面很近的距离（≤1nm）进行扫描。在这样近的距离内，针尖顶部可以接触到样品表面的电子云，但又不致损坏样品。此时在探针和样品之间加零点几伏的电压，即有纳安级的电流产生，这电流就是隧道效应电流。该电流对针尖至样品表面的距离非常敏感。当距离发生一个原子大小的变化时（0.3nm），电流将改变1000倍。利用电子学反馈控制系统保持探针扫描时的电流或高度恒定，就可以通过记录电压或电流的变化而了解样品的表面形貌（图2-11）。压电式换能器-30nm针尖原子针尖针尖轨迹观察物表面原子偏转电压图2-11扫描隧道显微镜工作原理示意图STM的横向分辨率可以达到0.1~0.2nm，纵向分辨率可以达到0.001nm，是目前分辨率最高的显微镜，足以对单个的原子进行观察。此外，由于STM在扫描时不接触样品，又没有高能电子束轰击，原则上讲可以避免样品的变形。而且，它不仅可以在真空，而且可以在保持样品生理条件的大气及液体环境下工作。因此，STM对生命科学研究领域具有十分重要的意义。目前，人们已利用STM直接观察到DNA、RNA和蛋白质等生物大分子，以及生物膜、古生菌的细胞壁、病毒等结构。近年来，在STM的基础上又发展出了另一种扫描探针式显微镜，原子力显微镜（atomic forcemicroscope，AFM）。AFM也是利用细小的探针对样品表面进行恒定高度的扫描来对样品进行观察”，但它不是通过隧道电流，而是通过一个激光装置来监测探针随样品表面的升降变化来获取样品表面形貌的信息，因此，与STM不同，AFM可以用于对不具导电性或导电能力较差的样品进行观察。二、显微观察样品的制备样品制备是显微技术的一个重要环节，直接影响着显微观察效果的好坏。一般来说，在利用显微镜观察、研究生物样品时，除要根据所用显微镜使用的特点采用合适的制样方法外，还应考虑生物样品的