3、酵母人工染色体 yeast artificial chromosome,YAC) YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOME VECTOR HUMAN DNA ●适用于克 ORI CEN 隆大片段 DNA, 0.2~2Mb。 amH BaDIGESTONOR 8 left arm right arm large chromosomal fragn DNA LIGATION AND YEAST CELL TRANSFORMATION 5.6x 10nucleotide pairs up to 10 nucleotide pairs 3.9 x 102 nucleotide pairs ARTIFICIAL YEAST CHROMOSOME WITH INSERTED HUMAN DNA
26 3、酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome, YAC） ⚫ 适用于克 隆大片段 DNA， 0.2~2Mb
1.Human DNA 2.YAC vector EcoRI A CEN ORI TELB HI TEL EcoRI Bam HI TEL ORI A sfcky ends ic内y ends Recombination CEN B TEL +DNA ligase 3.Yeast artificial chromosome with inserted human DNA TEL ORI A CEN B TEL up to 1000000 nucleoides pairs Clone Cloning into a Yeast Artificial Chromosome (YAC)
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YAC的主要功能成份有三： 着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色 体分离之必需。 端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 自主复制序列(ARS)元件：是染色体自主复 制的复制起点。 。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒， ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分 子，导入酵母细胞克隆
28 YAC 的主要功能成份有三： 着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色 体分离之必需。 端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复 制的复制起点。 ⚫ 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒， ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分 子，导入酵母细胞克隆
三、DNA重组与分子克隆化 ·为获得所需的基因或特异序列，需 从细胞中分离得到目的基因与载体 DNA重组，并用适当方法在宿主细 胞中表达，扩增得到大量相同的 DNA片段，称为DNA克隆，亦称 分子克隆
29 三、DNA重组与分子克隆化 ⚫ 为获得所需的基因或特异序列，需 从细胞中分离得到目的基因与载体 DNA重组，并用适当方法在宿主细 胞中表达，扩增得到大量相同的 DNA片段，称为DNA克隆，亦称 分子克隆
基本原理与过程： ·1、构建重组DNA:分离纯化目的基因 目的基因+vector=重组DNA分子 ●2、转化：重组DNA分子导入受体细胞，并在其 内增殖。 ·3、细胞克隆的筛选：筛选含有重组DNA的细胞一 一细胞克隆(celⅡclone),将转化的细胞至于琼 脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单 个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克 隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。 ●4、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞， 并选择分离重组DNA
30 基本原理与过程： ⚫ 1、构建重组DNA：分离纯化目的基因 目的基因 + vector =重组DNA分子 ⚫ 2、转化：重组DNA分子导入受体细胞，并在其 内增殖。 ⚫ 3、细胞克隆的筛选: 筛选含有重组DNA的细胞— —细胞克隆（cell clone），将转化的细胞至于琼 脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单 个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克 隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。 ⚫ 4、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞， 并选择分离重组DNA