目录 。全局转录机器工程有种实施策略.“ .29 全局转录机器工程育种实施方法.295 第三节全局转录机器工程育种应用实例. 295 第四节全局转录机器工程育种有关的其他菌种改造新方法. 296 思考题297 第十七章工业微生物生产菌的培养基优化. 298 第一节单因素优化方法.298 、单因素优化方法含义 .298 二，试验范围与试验精度”299 第二节正交试验优化方法 .299 一、正交的含义+299 二、正交试验设计的方法 . 300 、正交试伦结果+“4408000”00可 30 第三节均匀试验设计优化方法. 304 、均匀设计的特点 305 二、均匀设计在培养基优化中的应用. 305 三、均匀设计优化应用实例.306 四、均匀设计的注意事项 308 第四节响应面优化设计方法. 308 一、响应面法的含义及特点. 308 响应面法的应用实例 。 309 第五节人工神经网络优化方法. 314 一、人工神经网络优化的含义及特点 314 二、人工神经网络优化在培养基优化中的应用 314 思考题. .315 第十八章工程菌的高密度发酵技术.316 第一节工程菌高密度发酵技术及其工程学基础. 316 、高密度发形技术概述. 316 二、高密度发酵的工程学基础 316 第二节工程菌高密度发酵的主要影响因素及其控制. 318 营养成分的影响及其控制 319 二、祖度的影及其控制******** 320 三、pH的影响及其控制. 321 四、溶氧的彬响及其控制. 321 五、泡沫的影响及控制. 323 六、抑制性代谢副产物的影响及其控制.324 思考题. 324 第十九章工业微生物菌种的复壮与保藏. 325 第一节菌种的退化与复壮. 325
·xxi· 工业微生物育种学 、 菌种退化的原因.326 二、菊种退化的防止.328 三、菌种的复壮及其方法.33】 第二节工业微生物菌种的保藏.331 一、一般菌种保数. 332 二、菌种保藏注意事项.343 思考题.344 主要参考文献.345
第一章绪 论 第一节工业微生物育种在生物发酵产业中的地位 工业微生物南种选育在生物发酵产业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有工业 化价值及发酵过程成败与否的关键。现代发酵工业之所以如此迅猛发展，除了发酵工艺改进 和发酵设备更新之外，更重要的是由于进行了菌种的选育及其改良，为发酵工艺提供了人类需 要的各种类型的突变菌株，从而使抗生素、酶制剂、氨基酸、有机酸、维生素、核苷酸、激素、色 素，生物碱、不饱和脂肪酸以及其他生物活性物质等产品的产量成倍，甚至成千倍地增长，同时 产品的质量也不断提高。因此，工业微生物育种对于提高生物发酵产业产品的产量和质量，进 一步开发利用微生物资源，增加生物发酵产业产品的品种具有重大意义。 用于工业生产的微生物菌种要具有以下特性。 (1)在遗传上必须是稳定的。 (2)易于产生许多营养细胞、孢子或其他繁殖体 (3)必须是纯种，不应带其他杂菌及噬菌体。 (4)种子的生长必须旺盛、迅速。 (5)产生所需要的产物时间短。 (6)比较容易分离提纯。 ·(7)有自身保护机制，抵抗杂南污染能力强。 (8)能保持较长的良好经济性能。 (9)菌株对诱变剂处理较敏感，从而可能选育出高产菌株。 (10)在规定的时间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相对地稳定。 具备以上条件的菌株，才能保证发酵产品的产量和质量，这是发酵工业的最大目的和最低 要求。野生型菌株是不可能具备上述条件的，必须通过对野生型菌株的选育才能实现。发酵 工业为人们提供了各种各样的发酵产品，而工业微生物育种为发酵工业的上述贡献奠定了必 不可少的基础。 第二节工业微生物育种的进展 工业微生物育种，无论从自然变异中选择或是人工诱变的选择，都是建立在遗传和变异的 基础上。遗传和变异是生物界生命活动的基本属性之一。没有变异，生物界就失去进化的素 材：而没有遗传，变异也无法积累。同样，就优良菌株的选育来讲，没有变异就没有选择的素 材：没有遗传，选到的优良性状也不能进行培育。由此可见，工业微生物育种学是建立在微生 物遗传学基础上，而两者是相辅相成的。 微生物本身，在漫长的进化过程中，逐渐达到适合于它的生存和繁衍的水平。野生型微生 物经自然选择，能适应它的周围环境，能适应同其他物种的竞争，但却不能按照人的意志生产
2 工业微生物育种学 人们需要的物质。因此，从人类的利益出发，必须对工业微生物菌种进行改良，使之产生数量 远远超出微生物本身需要的物质，或者不是它正常产生的新物质。 对工业微生物菌种进行有目的的改良，是在有关微生物遗传学知识被人们了解并掌握之 后才成为可能的。同时，这种改良涉及多学科领域。 1927年，人们发现了X射线诱发突变。1945年后，各种具有诱变能力的辐射和化学诱变 剂的发现，为这种改良提供了非常有用的工具。通过诱变和筛选的“随机选择”，不仅在提高现 有产品的发酵单位上发挥了巨大作用，而且在当前多种新发酵产品的改进方面也具有很大潜 力。通过对诱变作用和DNA修复机制的深入了解，可以设计出所希望的突变型的最佳方案。 对基因表达和代谢途径调控机制的进一步阐明，可以设计出使所需要的突变特性得以充分表 达的筛选条件。自动仪表装置和微机的应用，则可使单位时间内获得分离的菌株数量大大增 加。这些技术的综合应用，使获得优良菌株的概率大为提高。 工业微牛物音种技术的发展大致经历如下阶段。 随着微生物学的发展，特别是发明微生物纯种培养法之后，开始了微生物纯种的自然 选育，对工业微生物育种有很大的影响。当时，在酒精发酵中，推广了自然选育的纯系良 种，扭转了酒精生产不稳定的现象。这是最早应用微生物遗传学原理于微生物育种实践而 提高发酵产物水平的一个成功实例。自然选育方法虽已沿用多年，迄今仍是工业微生物育 种的手段之一 由于自然突变频率低，单纯依赖自然界存在的微生物群体来进行的自然选育无疑有很大 局限性。继而进行了人工诱变选育，取得了很大效果。 20世纪40年代初，Beadle和Tatum采用X射线和紫外线等辐射因子来诱变红色面包 霉等，获得了各种代谢障得的变株，并于1941年提出“一个基因一种酶”的学说，闹述基因 与酶功能的直接关系，使遗传学从细胞水平发展到分子水平，促进了工业微生物育种技术 的发展 诱变育种是以人工诱变基因突变为基础的，过去是工业微生物育种的主要方法，至今仍是 世界各国行之有效的重要方法，尤其发酵工业中的各种优良高产菌株绝大部分都是以诱变育 种方法获得的。例如，抗生素生产中的青霉素产生菌特异青霉(Penicillium notatum)是1929 年英国的Flemirlg发现的。当时表层培养只有1~2U/ml,而1943年美国北部地区研究所实 验室分离出产黄青霉(Pem.chrysogenuam)NRRL9551同时伴以沉没培养成功，则达到20U/ml,在 此基出上，经时40多年的透变育种，到目前已法80000LU/m】以上，出原始菊株的产量根高了 上千倍。至于其他抗生素品种，如链霉素、土霉素、四环素、红霉素及灰黄霉素等，都由原来的 几十单位提高到目前的几万单位 除抗生素外，其他许多重要发酵产品也都由于进行了有效的菌种选育工作，在产量和质量 上都取得明显的提高，其主要手段也都是诱变育种 但是，某一菌株长期使用诱变剂处理之后，除产生诱变剂“疲劳效应”外，还会引起菌种生 长周期的延长、孢子量减少，代谢减慢等，这对发酵工艺的控制是不利的。而杂交育种可以作 为育种的另一手段，其成功不仅表现在种内杂交上，而且在种间杂交以至属间杂交都取得令人 满意的结果 杂交育种的最主要目的是把不同菌株的优良经济性状集中于重组体中，克服长期用诱变 剂处理造成的上述缺陷，同时杂交还是增加产品新品种的手段之一。当然，杂交育种也应当建
第一章绪论 。3。 立在诱变育种的基础上，没有诱变育种，杂交菌株的产量是难以继续提高的 代谢控制育种以20世纪50年代末谷氨酸发酵取得成功使发酵工业进入第三转折期 代谢控制发酵时期，并在其后的年代里得到飞跃的发展。 代谢控制育种活力在于以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过了微生物正常代谢途径 的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量生成和累积。代谢控制育种的崛起标志着诱 变育种发展到理性阶段，导致了氨基酸、核苷酸及某些次级代谢产物的高产菌株大批地投入 生产。 随者基因工程在工业微生物菌种选育中的应用，世界上以基因工程方法创造的各种工程 菌不计其数，实现了人为的菌种选育，一切可以按照人们事先设计和控制的方法进行育种，这 是一种最新的育种技术。 基因工程菌的构建和应用，已在多方面显示出其巨大的生命力。通过基因工程的方法生 产药物一一已获得包括治疗用药物、疫苗、单克隆抗体及诊断试剂等多种获得上市的品种：通 过基因工程方法提高菌株生产能力 一已获得包括氨基酸类、工业用酶制剂及头孢霉素C在 内的工程菌：通过基因工程方法改造传统发酵工艺 一如氧传递有关的血红蛋白基因克隆到 远青链霉菌，降低了对氧的敏感性；通过基因工程方法提高菌种抗性等。以上诸多类型的基因 工程菌构建，使工业微生物育种突破了传统的、经典的育种模式，在工业微生物育种中展示了 极为光明的前景 基因组改组(genome shuffing)是一种细胞定向进化技术。202年Zhang等在Nature 上首次发表了微生物基因组改组育种报道。基因组改组是多亲本微生物之间发生重组，先用 诱发突变或点突变技术产生复杂子代组合库，再利用改组技术将有利性状组合拼接，快速进化 目标菌的一种选育微生物的新方法。 基因组改组技术巧妙地模拟和发展了自然进化过程，以分子进化为核心，用工程学原理加 以人工设计，在实验室实现微生物全细胞快速定向进化，仅需1一2年就可完成自然界数百万 年才能达到的进化目标，使得人们能够在较短的时间内获得性状大幅度改良的正向突变的目 标菌株，成为微生物育种的前沿技术。 分子定向进化(directed molecular evolution)是一种DNA水平的分子定向进化技术。20 世纪90年代中期美国Arnold和Stemmer首先报道了蛋白质（酶）分子改造成功的例子，从此 拉开了酶蛋白分子定向进化育种的序幕。分子定向进化属于蛋白质（酶）非理性设计的主要范 畴，它不需要了解蛋白质的空间结构和催化机制，在实验室中人为创造特殊的进化条件，模拟 自然进化机制，在体外进行酶蛋白基因的改造，并定向筛选出所需特性的突变蛋白。这样就能 在较短时间内完成漫长的自然进化过程，甚至可以在几个月或几周的时间内创造出优化的酶 蛋白，而在自然的进化过程中，要得到这个结果需要几千万年之久。 高通量筛选(high-throughput screening)是微生物育种技术的重要组成部分，在工业微生 物育种过程中，无论是传统的诱变育种、杂交育种、基因组改组育种、现代基因工程育种及分子 定向进化育种等，建库后，都要对文库进行筛选。而文库的库容量很大，各个样品的质量参差 不齐，具有很大的随机性。使用传统零敲碎打的筛选方法，筛选量低，概率小，工作量大，要耗 费大量的人力、物力。在这种背景下，高通量筛选技术孕育而生。 高通量筛选技术的核心，首先必须根据目的样品的特性，开发出合适的筛选模型，将样品 的这些特性转化成可以用摄像头和计算机传感器识别的光信号或者电信号。此外，要有自动