。4, 工业微生物育种学 化或者自动化的实验操作系统，能够进行移液、接种、清洗等设备操作。而且必须具备以下特 点：具有在高洁净度下工作的能力，不引起污染，可多通道一次性进行多组操作，操作速度快， 具有良好的软件和硬件兼容性，能与监测设备对接，实验数据可以在多种软件平台上进行分 析，能使用各种通用型规格的耗材。 随着工业微生物育种技术的不断创新，尤其分子育种的手段与方法有了崭新的进展，极大 地丰富了工业微生物育种的内容。 在工业微生物生产菌种基因的表达系统方面，除了最早采用的原核表达系统和随后采用 的酵母表达系统外，还实现了丝状真菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统，为工业微生物工程 菌的构建创造了创新性的技术基础 为提高工业微生物生产菌株的产量，重组载体诱变方法已得以实现，其中质粒直接诱变可 通过化学诱变剂与质粒反应时间的长短来控制突变率，筛选日的突变菌株已有成功实例。 基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的一种分子生物学方法，它具 有定位性强、插人基因随染色体DNA稳定遗传、操作方便等优点。它为定向改造工业微生物 品种提供了重要的技术支撑。笔者在阐明芳香族氨基酸代谢途径的基础上，通过敲除L色氨 酸菌株的tyrA基因获得了酪氨酸营养缺陷型菌株，应用这种营养缺陷型，可使代谢支路的中 间体预苯酸不流向酪氨酸生成的方向，使色氨酸的合成有充足的原料。发酵试验结果显示：工 程菌的发酵液中没有酪氨酸的存在，同时L色氨酸的产量较原始菌株提高近1倍，同样，该技 术也在L苯丙氨酸的工程菌构建中取得成功。 全局转录机器工程育种是一种通过引入全局转录扰动来获得多尺度细胞表型突变库的新 方法，可以快速、高效地获得性能显著提升的细胞表型重要新技术。 工业微生物高密度培养，又称高细跑密度发酵技术，是在传统发酵技术上改进的发酵技 术，利用一定的培养技术和装置，极大地改进了发酵工艺，使菌体密度较普通培养有显著提高， 增加工程菌对数期的生长时间、相对缩短衰亡时间来提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比 生产率，不仅可诚少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期，诚少设备投资从而降 低生产成本，极大地提高市场竞争力。 工业徽生物工程菌构建成功之后，关键还在于如何在特定的装备条件下，使其目的产物高 效表达最大化，其中工业徽生物工程菌的培养基优化是使该工程菌株高产性状及其他优良特 性高效表达的重要发酵技术，除传统的正交试验优化方法外，均匀实验设计优化方法、响应面 法优化设计和人工神经网络优化方法都得到了广泛的应用，并取得了显著的效果。 纵观上述，正由于工业微生物育种技术的不断创新，促进了对生物发酵产业总体技术水平 的提高，不仅使传统生物发酵产业在工艺改进、工艺创新和提高产品质量等方面起到了重要的 推动作用，而且也使现代生物发酵产业建立了从被动筛选到主动合成的技术平台，促进了我国 生物发酵产业的发展 思考题 1.简述工业生产的微生物菌种特点。 2。简述工业微生物育种技术的方法及其特点
第二章遗传物质的基础 生物的性状由遗传物质决定。随着遗传学的发展，遗传物质的本质不断被揭示。孟德 尔(G.J.Mendel)1856~1864年在从事豌豆杂交试验过程中，首先发现分离和独立分配遗传 规律，认为生物性状是受细胞里的颗粒性遗传因子控制，但是，这种遗传因子只是一种逻辑 推理产物，没有任何物质内容。约翰生(W.Johannsen)l909年用“基因"”(gene)一词代替 孟德尔的遗传因子概念，但也没有给出“基因”的物质内容。贝特生(W.Batso)和摩尔根 (T.H.Morgan)1900~1910年期间先后在香豌豆、果蝇的遗传研究中发现性状连锁 (linkage)现象。尤其是摩尔根在大量果蝇遗传研究基础上提出了连锁遗传规律，同时，结合 染色体动态研究结果提出“基因位于染色体上，基因是染色体的一段片段”。限于当时的科 学水平，摩尔根还不能对基因赋予实体的内容，但他预见了基因将是一个化学实体。阿委 瑞(O.T.Avey)证明DNA是遗传物质。沃森(J,D.Watson)和克里克(F.H.C.Crick)于20世 纪50年代前后提出DNA双螺旋结构模型，明确了DNA是遗传信息的载体，是遗传物质， 基因是DNA分子上的一个片段。除了DNA外，有些动物、植物病毒和噬菌体是以RNA作 为遗传物质的 遗传物质主要分布在真核生物的细胞核、原核生物的原核中。细胞质中的某些细胞器，如 叶绿体、线粒体、质体等也含有遗传物质。 随着物理、化学、分子生物学等先进技术和设备的应用，对遗传物质基本单位一基因的 本质、组织结构等的认识越来越深人，也赋予基因新的内容，形成基因组学这门学科。 第一节染色体 所有细胞型生物都具有携带基因的结构，这种结构称为染色体(chromosome)。然而，染 色体在原核生物与真核生物之间存在差别：原核生物的染色体由环状双链和极少的蛋白质构 成，细胞中仅有单个染色体，每个染色体有单一的DNA复制起始位点，染色体包含在核质体 中。真核生物有若干条线性染色体，DNA与大量的蛋白质紧密结合，每一真核生物具有多个 DNA复制起始位点，染色体包含在细胞核中。 一、染色体形态 根据着丝粒的位置可以把染色体分为四种典型的形态，它们分别是：①中着丝粒染色体： 其着丝粒位于染色体中部附近，染色体具有几乎等长的两臂：②近中着丝粒染色体：其着丝粒 位置偏离染色体中位，染色体具有长、短两臂；③端着丝粒染色体：其着丝粒位于染色体的端 部，染色体只有一个臂；④近端着丝粒染色体：其着丝粒几乎位于染色体的端部，染色体有一个 长臂，有一个极短的短臂（图2.1）。 所有真核生物的染色体具有者丝粒和端粒这两个重要区域。此外，某些染色体还具有核
·6 工业微生物育种学 仁形成区。着丝粒在细胞分裂过程中，作为纺锤 丝的附着点，缺乏着丝粒，细胞将无法进行正常的 分裂。 端粒不仅是染色体末端的一个区域，它还具 有特殊的结构。在端粒区域，含有DNA重复序列 (repeat sequence),如人类的该序列为TTAGGG。 在生殖细胞中，每个端粒含有大量的重复序列，但 是随着体细胞衰老，端粒中的重复序列数量逐浙 端着丝粒 减少。维持端粒长度的恒定要靠端粒酶。研究发 现，在体细胞中缺少端粒酶，但在肿瘤细胞中重新 出现了端粒酶。 核仁形成区通常存在于次缢痕区。该区含有 重复的rRNA基因，在细胞分裂间期，核仁形成区 图2.1染色体形态 解凝聚，其周围形成核仁。 二、原核生物及病毒染色体结构 以大肠杆菌为例来阐明原核生物染色体的结构特点 大肠杆菌染色体以单个双链环状DNA分子构成，大约有4.6×10bp。这种染色体组成 了大肠杆菌的拟核（核质体）。在拟核中DNA占8O%,其余为RNA和蛋白质。DNA与蛋白 质相互作用形成“脚手架”形结构（图2.2）。在这种结构中，DNA链形成了50~100个功能域 或环。每个环都是超螺旋结构，每个环的DNA有两个端点被蛋白质固定。每个环大约有 50一1OOkb。当用微量的DNA酶I处理，会使少量DNA环成为松弛状态，而其他环保持超螺 旋状态不变， 涨涨 图2.2大肠杆菌染色体的“脚手架“形结构及微量DNA酶【作用示意图 染色体环状DNA功能域将进一步与DNA结合蛋白结合。在DNA结合蛋白质中，含量 最丰富的为HU蛋白，另外还有HNS蛋白。这些蛋白质有时也称为类组蛋白。 病毒没有典型的染色体结构。习惯上把病毒含有的RNA或DNA也称为染色体。对DNA 病毒来说，不同的病毒其DNA形态结构多种多样，如DNA可以是单链，也可以是双链；可以是 环状，也可以是线状。对RNA病毒来说，RNA为线状，RNA可以为单链，也可以为双链，甚至含
第二章遗传物质的基础 7 有多条RNA链。X174是一种大肠杆菌噬菌体，其 DNA为单链环状，共有5386个核苷酸，由于其DNA中 含有重叠基因，故其可以编码10个基因（图2.3）. 三、真核生物染色体结构 在原核生物中，构成染色体的成分主要是DNA。 真核生物染色体由高度有序的DNA蛋白质复合体（核 蛋白)构成，这种复合体称为染色质(chromatin)。染色 质中超过50%的成分为蛋白质，在细胞周期的不同阶 DmO 段，由于染色质组织结构的变化而导致不同的染色体 结构状态 图2.3噬菌体ΦX174的重叠基因示意图 在细胞分裂中期，染色体呈高度的凝聚结构状态， X174的10个基因，其中基因E和D重叠，共 而在间期则呈现弥散状态。染色体结构上的变化，均 因A,B.KC重叠，黑色部分表示基因阿序列 是不同的染色质组织水平造成的。染色质中主要的蛋白质成分是组蛋白，具体包括五种类型 它们分别是H2AH2B,H3、H4和H1,而H2AH2B、H3、H4又称为核心组蛋白(core his tone)。它们的分子质量为10~20kDa。H1分子质量稍大，为23kDa。所有组蛋白均带正电 荷，蛋白质中20%一30%的氨基酸为碱性氨基酸，如赖氨酸、精氨酸等。由于组蛋白带正电 荷，故其与带负电荷的DNA结合得非常紧密。 核小体是染色质结构的基本单位。核小体由核小体核心颗粒和H1组蛋白构成，核小体 核心颗粒由(H2A)2、(H2B)2、(H3)2、(H4)2组蛋白形成的八聚体和146bp的DNA构成 DNA环绕在组蛋白八聚体上，环绕数为1.8个超螺旋。在核小体中，绕在八聚体上的DNA 进出端靠组蛋白H1来锁定。当有H1存在时，绕在八聚体上的DNA链将加长20bp,这样环 绕在八聚体上的超螺旋达到两圈。比起H2A、H2B、H3、H4,组蛋白H1较不稳定，在某些细 胞类型中，组蛋白H1会被一种组蛋白变异体H5代替。组蛋白H5可以与DNA紧密结合， 造成染色质结构过分致密，从而导致基因不能转录。 核小体之间靠连接区DNA相互连接形成“念珠”状的染色质丝。连接区DNA长度平均 为55bp。但是不同物种和组织之间，连接区DNA数目变化很大，范围一般为0~100bp以上。 串成“念珠”形态的核小体在组蛋白H作用下，进一步形成“之”形结构，并进一步形成纤 丝直径为30m的纤丝，每一圈由6个核小体组成。30nm纤丝进一步弯曲，并结合在核基质 上形成染色体（图2.4）。 在真核生物染色质中，有常染色质和异染色质之分。常染色质区具有基因转录活性，异染 色质区没有转录活性，通常分布在着丝粒附近，异染色质区中含有重复的卫星DNA。 四、染色体数目 真核生物多数为二倍体(diploid)生物，原核生物大多为单倍体(haploid)生物。减数分裂 中染色体行为发生差错，常常引起染色体数目的变化。整倍体(euploid)是指个体中的染色体 数为基数的整倍数，如一倍体、二倍体、三倍体等类型。三倍体以上叫做多倍体(polyploid)
·8 工业微生物育种学 安头DN 核小休核心颗粒 B ①① 组蛋白 Gon2 核基 超级螺线管 组蛋白人聚材 DNA哀银能 螺线管 中期染色体 图24真核生物染色体分子结构 A成“念珠"状的染色质丝。B核小体卷曲成螺旋管。C左边：由HI组蛋白，核心组蛋白八聚体和DNA组成的染色质 小体：右边：染色质小体结合在核基质上形成染色体，此为染色体的制面图。D.DNA逐级螺旋压缩最终成为染色体 以人为例，人的染色体基数为23条，那么二倍体细胞有46条染色体，三倍体细胞有69条染色 体。多倍体现象在动物中极少见到，但是，在植物中却是常见的现象。 非整倍体(aneuploid)是指体细胞核中具有非整倍数染色体，其中某一个或某几个染色体 多于或少于正常二倍体染色体数，如缺对性个体、单体性个体、二体性个体，三体性个体。一个 二倍体细胞中缺少某一对或某几对染色体，这类个体就叫做缺对性个体；缺少某一对或某几对 染色体中的一条染色体，这种个体就叫做单体性个体，配子属于单体性个体；某一对或某几对 染色体增加一条染色体，这种个体就称为三体性个体。二倍体生物的体细胞是二体性的