枯草芽孢杆菌(Bα cillus subtilis)枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5 -核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。 4、根霉( Rhizopus)代表种:米根霉、黑根霉等 应用:根霉能产生一些酶类,如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等。在酿酒工业上常用做糖化菌 5、曲霉(4 spergillus))代表种:黑曲霉、黄曲霉 应用:是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、果胶酶)的菌种。生产有机酸 如柠檬酸、葡萄糖酸等)。农业上用作生产糖化饲料的菌种。 第三节、醵的发酵工艺条件与控制 细胞的活化、种子扩大培养、培养基(碳源、氮源、无机盐、生长因素和产酶促进剂等)、发酵方法 (固体培养法、液体培养法) 培养基培养基( medium)是人工配制的,适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。 培养基的设计原则:1)选择适宜的营养物质2)营养物的浓度及配比合适 3)物理、化学条件适宜4羟经济节约5)精心设计、试验比较 任何培养基都应该具备微生物生长所需要,五大要素:碳源、氮源、无机盐、生长因子、水 、发酵条件及控制 1、p值的控制不同的细胞,其生长繁殖的最适p值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适pH值在中 性或碱性范围(pH6.5~8.0);霉菌和酵母的最适生长pH值为偏酸性(pH4~6);植物细胞生长的最适pH 值为5~6。 细胞发酵产酶的最适p值与生长最适p值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该 酶催化反应的最适p值。 有些细胞可以同时产生若干种酶,在生产过程中,通过控制培养基的p值,往往可以改变各种酶之间的产 量比例。 温度的调节控制 细胞的生长繁殖和发酵产酶需要一定的温度条件。在一定的温度范围内,细胞才能正常生长、繁殖和 维持正常的新陈代谢。 不同的细胞有各自不同的最适生长温度。例如,枯草杆菌的最适生长温度为34~37C,黑曲霉的最适 生长温度为28~32℃等。 有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同,而且往往低于生长最适温度。这是由于 在较低的温度条件下,可以提高酶所对应的mRNA的稳定性,增加酶生物合成的延续时间,从而提高酶的产 量。但是细胞生长速度较慢。若温度太低,则由于代谢速度缓慢,反而降低酶的产量,延长发酵周期 3、溶解氧的调节控制 细胞必须获得充足的氧气,使从培养基中获得的能源物质(一般是指各种碳源)经过有氧降解而生成 大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量ATP。 在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧。在发酵过程中必须不断供给氧(一般通过供给无 菌空气来实现),使培养基中的溶解氧保持在一定的水平 三、提高酶产量的措施 1、添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产,在发酵过程中的某个适宜的时机,添加适宜的诱导物,可以显著提高酶的产 量。诱导物一般可以分为3类:酶的作用底物,酶的催化反应产物和作用底物的类似物。 2、控制阻遏物的浓度 为了提高酶产量,必须设法解除阻遏物引起的阻遏作用 阻遏作用根据其作用机理的不同,可以分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。 ◇为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用,应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度
6 3、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5’ -核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。 4、 根霉(Rhizopus) 代表种：米根霉、黑根霉等。 应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等。在酿酒工业上常用做糖化菌。 5、 曲霉(Aspergillus) 代表种：黑曲霉、黄曲霉 应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸 （如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。 第三节、 酶的发酵工艺条件与控制 细胞的活化、种子扩大培养、培养基（碳源、氮源、无机盐、生长因素和产酶促进剂等）、发酵方法 （固体培养法、液体培养法） 一、培养基 培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。 培养基的设计原则：1）选择适宜的营养物质 2）营养物的浓度及配比合适 3）物理、化学条件适宜 4)经济节约 5)精心设计、试验比较 任何培养基都应该具备微生物生长所需要, 五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水 二、发酵条件及控制 1、pH 值的控制 不同的细胞，其生长繁殖的最适 pH 值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适 pH 值在中 性或碱性范围（pH6.5～8.0）；霉菌和酵母的最适生长 pH 值为偏酸性(pH4～6)；植物细胞生长的最适 pH 值为 5～6。 细胞发酵产酶的最适 pH 值与生长最适 pH 值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适 pH 值通常接近于该 酶催化反应的最适 pH 值。 有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的 pH 值，往往可以改变各种酶之间的产 量比例。 2、温度的调节控制 细胞的生长繁殖和发酵产酶需要一定的温度条件。在一定的温度范围内，细胞才能正常生长、繁殖和 维持正常的新陈代谢。 不同的细胞有各自不同的最适生长温度。例如，枯草杆菌的最适生长温度为 34～37o C，黑曲霉的最适 生长温度为 28～32 o C 等。 有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于 在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的 mRNA 的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产 量。但是细胞生长速度较慢。若温度太低，则由于代谢速度缓慢，反而降低酶的产量，延长发酵周期。 3、溶解氧的调节控制 细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质（一般是指各种碳源）经过有氧降解而生成 大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量 ATP。 在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧。在发酵过程中必须不断供给氧（一般通过供给无 菌空气来实现），使培养基中的溶解氧保持在一定的水平。 三、提高酶产量的措施 1、添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产 量。诱导物一般可以分为 3 类:酶的作用底物，酶的催化反应产物和作用底物的类似物。 2、控制阻遏物的浓度 为了提高酶产量，必须设法解除阻遏物引起的阻遏作用。 阻遏作用根据其作用机理的不同，可以分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。 ◇为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度
◇对于受代谢途径末端产物阻遏的酶,可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除 3、添加表面活性剂 表面活性剂可以与细胞膜相互作用,增加细胞的透过性,有利于胞外酶的分泌,从而提高酶的产量 表面活性剂离子型和非离子型两大类。其中,离子型表面活性剂又可以分为阳离子型、阴离子型和两 性离子型3种。将适量的非离子型表面活性剂,如吐温( Tween)、特里顿( Triton)等添加到培养基中, 可以加速胞外酶的分泌,而使酶的产量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用,尤其是季胺型表面活性剂(如‘新洁而灭’等)是消毒剂, 对细胞的毒性较大,不能在酶的发酵生产中添加到培养基中 4、添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产过程中,添加适宜 的产酶促进剂,往往可以显著提高酶的产量 第四节生产过程的动力学 细胞在一定条件下培养生长,其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段。 、酶生物合成的模式 同步合成型,延续合成型,中期合成型和滞后合成型。 (1)同步合成型:酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细 胞生长速度紧密联系,又称为生长偶联型。 (2)延续合成型:酶的生物合成在细胞的生长阶段开始,在细胞生长进入平衡期后,酶还可以延续合 成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶,也可以是诱导酶。 (3)中期合成型:该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始,而在细胞生长进入平衡期以后,酶的 生物合成也随着停止 (4).滞后合成型:此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积 累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 综上所述,酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。 二、酶发酵动力学 酵动力学是研究发酵工程中细胞生长速率、产物生成速率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响 规律的学科。发酵动力学包括:细胞生长动力学、产物生成动力学、基质消耗动力学 1)细胞生长动力学细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规 2)产酶动力学 产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼,研究群体细胞的产酶速率及其影响因素,这称为宏观产酶动 力学或这称为非结构动力学。也可以从细胞内部着眼,研究细胞中酶合成速率及其影响因素,这谓之微观 产酶动力学或称为结构动力学。 3)基质消耗动力学被消耗的基质主要用于细胞生长、产物生成、和维持细胞的正常新陈代谢三个方面 第四章酶的分离和纯化(8学时) (一)教学目的与要求: 学习目的与要求:通过教学使学生了解酶原材料的选择的基本原则,细胞破碎方法以及酶分离纯化的各种方 法原理,理解和思考酶提取过程中应注意的主要问题。重点掌握根据酶分子大小和轻重设计的酶的分离纯 化方法、根据酶的溶解度设计的分离方法、根据酶分子电荷多少和正负设计的分离方法,了解根据亲和性 设计的分离方法和根据吸附性设计的分离方法。掌握酶的结晶、浓缩与干燥的基本原理与方法。 (二)教学的重点与难点分析:
7 ◇对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。 3、添加表面活性剂 表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。 表面活性剂离子型和非离子型两大类。其中，离子型表面活性剂又可以分为阳离子型、阴离子型和两 性离子型 3 种。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿（Triton）等添加到培养基中， 可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如‘新洁而灭’等）是消毒剂， 对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。 4、添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产过程中，添加适宜 的产酶促进剂，往往可以显著提高酶的产量。 第四节 酶生产过程的动力学 细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等 4 个阶段。 一、 酶生物合成的模式 同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。 (1)同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细 胞生长速度紧密联系， 又称为生长偶联型。 (2)延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合 成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。 (3)中期合成型：该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的 生物合成也随着停止。 (4)．滞后合成型：此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积 累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 综上所述，酶所对应的 mRNA 的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。 二、酶发酵动力学 酵动力学是研究发酵工程中细胞生长速率、产物生成速率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响 规律的学科。发酵动力学包括：细胞生长动力学、产物生成动力学、基质消耗动力学 1）细胞生长动力学 细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规 律。 2）产酶动力学 产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动 力学或这称为非结构动力学。 也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观 产酶动力学或称为结构动力学。 3）基质消耗动力学 被消耗的基质主要用于细胞生长、产物生成、和维持细胞的正常新陈代谢三个方面 第四章 酶的分离和纯化（8 学时） （一）教学目的与要求： 学习目的与要求: 通过教学使学生了解酶原材料的选择的基本原则，细胞破碎方法以及酶分离纯化的各种方 法原理，理解和思考酶提取过程中应注意的主要问题。重点掌握根据酶分子大小和轻重设计的酶的分离纯 化方法、根据酶的溶解度设计的分离方法、根据酶分子电荷多少和正负设计的分离方法，了解根据亲和性 设计的分离方法和根据吸附性设计的分离方法。掌握酶的结晶、浓缩与干燥的基本原理与方法。 （二）教学的重点与难点分析：