《植物学报》：橡胶草的研究进展（仇键、张继川、罗世巧、校现周、王锋、张立群、刘实忠）

植物 hineseBulletinofBotany2015,50(1):133-141,www.chinbullbotany.com doi:103724/SPJ1259201500133 专题论坛 橡胶草的研究进展 仇键1,张继川3,罗世巧1,校现周1,王锋,张立群3,刘实忠12 中国热带农业科学院橡胶研究所,农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室,儋州571737 中国热带农业科学院湛江实验站,湛江524013;3先进弹性体研究中心,北京化工大学材料科学与工程学院,北京100029 4山东玲珑轮胎有限公司,招远265406 摘要天然橡胶是一种不可替代的重要战略工业原料,用途广泛。巴西橡胶树作为天然橡胶的主要来源,受种植面积限制, 难以满足全球日益增长的对天然橡胶的需求。而南美叶疫病也是巴西橡胶树( Hevea brasiliensis))安全的潜在威胁。蒲公英 属产胶植物(橡胶草)最早发现于20世纪30年代,可产生高质量的天然橡胶,具有生长周期短、地理适应范围广、适合机械 化生产等特点,被认为是一种理想的产胶备选作物。该文从橡胶草种质资源、遗传改良、栽培技术及产胶生物学机制等方 面综述了国内外橡胶草的研究进展和存在的问题,并为我国开展橡胶草相关研究提出建议 关键词天然橡胶,俄罗斯蒲公英,短角蒲公英,种质资源,生物合成 仇键,张繼川,罗世巧,校现周,王锋,张立群,刘实忠(2015).橡胶草的研究进展.植物学报50,133-141. 天然橡胶是产胶植物中合成的聚异戊二烯高分等,2013),存在严重的天然橡胶战略物资安全隐患。 子化合物,与钢铁、石油、煤炭并称为四大工业原料,橡胶草原产于哈萨克斯坦和我国新疆天山山谷-特克 在军用、民用工业上都发挥了不可替代的作用。自然斯河流域,喜冷凉,在亚热带和温带也可生长,其根 界中,超过2500种植物能合成天然橡胶,但大多分中含有高质量天然橡胶289%-27.89%罗士苇等 子量太小,仅巴西橡胶树( Hevea brasiliaηsjs)、银色1951)。因此在我国广袤的北方地区种植橡胶草、发 橡胶菊(βarπiheη nium argentatum以及蒲公英属橡胶展蒲公英橡胶可能是保障我国天然橡胶战略物资安 草(包括俄罗斯蒲公英和短角蒲公英)可产生1000全的有效途径之一。在此背景下,本文综述了国内外 kDa以上的天然橡胶而具有应用价值。巴西橡胶树是橡胶草的硏究进展,并对存在的问题进行探讨,以期 目前唯一大面积商业化种植的产胶植物,主要分布于为我国蒲公英属橡胶草的研发提供参考 亚洲、非洲和南美等热带及亚热带地区,其中亚洲橡 胶产量占全球93%,而南美作为巴西橡胶树原产地,1橡胶草种质资源 受叶疫病影响,其产量仅占2%左右。近年来,由于天 然橡胶供不应求,石油资源(合成橡胶来源)日趋枯竭,11橡胶草种质资源定义 以及巴西橡胶树作为单一产胶植物可能面临的潜在橡胶草是我国对俄罗斯浦公英的俗称,由俄罗斯植物 威胁,例如南美叶疫病( van Beilen and Poirier,学家Rodn于1931年在哈斯克斯坦境内天山山谷中 2007a,2007b),使各国认识到发展巴西橡胶之外的发现,1934年正式定名为 Taraxacum koksaghyz 天然橡胶资源的重要性,相继启动了巴西橡胶树替代 Rodin。按照 Rodin的描述,俄罗斯蒲公英为菊科 产胶作物的研发,如美国 PENRA和欧盟 EU-PEAR- (Asteraceae)蒲公英属( Taraxacum)多年生宿根草本 LS项目。 植物,自交不亲和;其干根折断后有橡胶丝;叶肉质, 我国是世界上最大的橡胶产品消耗国,受国内橡略带蓝青色,叶缘无锯齿;花序总苞尖端有小角(图 胶树种植面积限制,天然橡胶自给率不足13(祁栋灵1)。近些年,由于对俄罗斯蒲公英的研究中断和认知 2013-11-29;接受日期:20140403 国家天然橡胶产业体系( No CARS-34GW7)、因家自然科学基金(No31400579)、海南省自然科学基金(No314139)和中国热 院橡胶研究所基本科研业务费专项(No.1630022013023) E-mail:Szlu@126.com

植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (1): 133–141, www.chinbullbotany.com doi: 10.3724/SP.J.1259.2015.00133 —————————————————— 收稿日期: 2013-11-29; 接受日期: 2014-04-03 基金项目: 国家天然橡胶产业体系(No.CARS-34-GW7)、国家自然科学基金(No.31400579)、海南省自然科学基金(No.314139)和中国热 带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费专项(No.1630022013023) * 通讯作者。E-mail: sz_liu@126.com 橡胶草的研究进展 仇键1 , 张继川3 , 罗世巧1 , 校现周1 , 王锋4 , 张立群3 , 刘实忠1, 2* 1 中国热带农业科学院橡胶研究所, 农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室, 儋州 571737 2 中国热带农业科学院湛江实验站, 湛江 524013; 3 先进弹性体研究中心, 北京化工大学材料科学与工程学院, 北京 100029 4 山东玲珑轮胎有限公司, 招远 265406 摘要 天然橡胶是一种不可替代的重要战略工业原料, 用途广泛。巴西橡胶树作为天然橡胶的主要来源, 受种植面积限制, 难以满足全球日益增长的对天然橡胶的需求。而南美叶疫病也是巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)安全的潜在威胁。蒲公英 属产胶植物(橡胶草)最早发现于20世纪30年代, 可产生高质量的天然橡胶, 具有生长周期短、地理适应范围广、适合机械 化生产等特点, 被认为是一种理想的产胶备选作物。该文从橡胶草种质资源、遗传改良、栽培技术及产胶生物学机制等方 面综述了国内外橡胶草的研究进展和存在的问题, 并为我国开展橡胶草相关研究提出建议。 关键词 天然橡胶, 俄罗斯蒲公英, 短角蒲公英, 种质资源, 生物合成 仇键, 张继川, 罗世巧, 校现周, 王锋, 张立群, 刘实忠 (2015). 橡胶草的研究进展. 植物学报 50, 133–141. 天然橡胶是产胶植物中合成的聚异戊二烯高分 子化合物, 与钢铁、石油、煤炭并称为四大工业原料, 在军用、民用工业上都发挥了不可替代的作用。自然 界中, 超过2 500种植物能合成天然橡胶, 但大多分 子量太小, 仅巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)、银色 橡胶菊(Parthenium argentatum)以及蒲公英属橡胶 草(包括俄罗斯蒲公英和短角蒲公英)可产生1 000 kDa以上的天然橡胶而具有应用价值。巴西橡胶树是 目前唯一大面积商业化种植的产胶植物, 主要分布于 亚洲、非洲和南美等热带及亚热带地区, 其中亚洲橡 胶产量占全球93%, 而南美作为巴西橡胶树原产地, 受叶疫病影响, 其产量仅占2%左右。近年来, 由于天 然橡胶供不应求, 石油资源(合成橡胶来源)日趋枯竭, 以及巴西橡胶树作为单一产胶植物可能面临的潜在 威胁, 例如南美叶疫病(van Beilen and Poirier, 2007a, 2007b), 使各国认识到发展巴西橡胶之外的 天然橡胶资源的重要性, 相继启动了巴西橡胶树替代 产胶作物的研发, 如美国PENRA和欧盟EU-PEAR￾LS项目。 我国是世界上最大的橡胶产品消耗国, 受国内橡 胶树种植面积限制, 天然橡胶自给率不足1/3(祁栋灵 等, 2013), 存在严重的天然橡胶战略物资安全隐患。 橡胶草原产于哈萨克斯坦和我国新疆天山山谷-特克 斯河流域, 喜冷凉, 在亚热带和温带也可生长, 其根 中含有高质量天然橡胶2.89%–27.89%(罗士苇等, 1951)。因此在我国广袤的北方地区种植橡胶草、发 展蒲公英橡胶可能是保障我国天然橡胶战略物资安 全的有效途径之一。在此背景下, 本文综述了国内外 橡胶草的研究进展, 并对存在的问题进行探讨, 以期 为我国蒲公英属橡胶草的研发提供参考。 1 橡胶草种质资源 1.1 橡胶草种质资源定义 橡胶草是我国对俄罗斯蒲公英的俗称, 由俄罗斯植物 学家Rodin于1931年在哈斯克斯坦境内天山山谷中 发现, 1934年正式定名为Taraxacum koksaghyz Rodin。按照Rodin的描述, 俄罗斯蒲公英为菊科 (Asteraceae)蒲公英属(Taraxacum)多年生宿根草本 植物, 自交不亲和; 其干根折断后有橡胶丝; 叶肉质, 略带蓝青色, 叶缘无锯齿; 花序总苞尖端有小角(图 1)。近些年, 由于对俄罗斯蒲公英的研究中断和认知 ·专题论坛·

134植物学报50(1)2015 囊 B 图1俄罗斯蒲公英(A)(来自美国农业部种子库NSL219131)和短角蒲公英(B)(采集于新疆特克斯河谷)的植株形态比较 Figure 1 The phenotypic comparison of Taraxacum koksaghyz(A)(NSL219131)and T. brevicorniculatum(B)(collected from Tekes River, Zhaosu, Xinjiang) 不足,德国科学家将蒲公英属短角蒲公英(T.brev-瓦维洛夫植物研究所,1份可共享的种质(NSL219 corniculatum)误当作俄罗斯蒲公英进行研究(Schm-131)保存于美国农业部种子库。而短角蒲公英则在德 dt et al,2010a)。事实上,短角蒲公英与俄罗斯蒲公国卡尔斯鲁厄植物园、马尔堡大学、美国俄亥俄州立 英野生生长区域重叠,可能是俄罗斯蒲公英与四倍体大学 OARDC以及荷兰 KEYGENE公司等机构中均有 蒲公英属植物的杂交后代;可无融合生殖;叶呈倒披保存( Kirschner et al.,2013)。我国于1950年在新疆 针形,羽状深裂,叶色淡绿(图1);其干根含胶量仅为自治区昭苏县特克斯河谷采得俄罗斯蒲公英,其粗胶 前者的14-1/2,被认为是一种低劣的产胶植物(Sh含量为2239%,但无保存记录(林伯煌和魏小弟, etal.,2011; van Dijk and Lecoulant,2012;Kir-2009a)。近些年,随着橡胶草研究的兴起,橡胶草种 chner et al,2013)。由于短角蒲公英生物量大、繁质缺乏的现状促使橡胶草野生种质资源的调查、收集 殖能力强,有利于橡胶草相关性状的遗传改良,因此和保存工作重新开展。vois等(2009)考察哈斯克斯坦 备受育种专家关注。种质资源的定义是作物及其可遗境内 Kegen河流域,发现俄罗斯蒲公英野生种质稀 传物质的总和,包括野生种、近缘植物、古老品种以少,含胶量也远低于文献报道,他们认为20世纪50年 及改良品种等类型(韩振海,2009)。蒲公英属植物大代的过度采掘导致野生资源极度匮乏。相反,Kr 多有乳管,可产生胶乳,且无生殖隔离( van Dijk et schner研究组考察哈萨克斯坦 Kegen- Sarydzhaz al,1999)因此广义上橡胶草种质资源可涵盖大多数 Tuzkel- Tekes谷地后发现,大量俄罗斯蒲公英野生 蒲公英属产胶植物,包括俄罗斯蒲公英、短角蒲公英种群分布于潮湿高盐或干燥高盐低海拔区域,其中大 以及西洋蒲公英(T. officina/e)等。 种群(个体数量大于1000)18个 van Dijk et a 2010)。自1996年,中国热带农业科学院、石河子大 12橡胶草野生种质收集和保存 学、北京化工大学和海南大学(李若霖,2012)等单位 野生种质是橡胶草种质资源的主要类型。俄罗斯曾大也相继对我国新疆地区橡胶草野生资源进行考察,但 规模采集橡胶草野生种质进行种植驯化。美国、徳国、尚未见我国野生资源现状的报道 加拿大和澳大利亚等国也进行过短暂的引种试种。但 随着苏联解体和橡胶草被淘汰,这些古老种质大多流 13橡胶草种质评价 失。目前,仅30余份俄罗斯蒲公英种质保存于俄罗斯种质评价是种质资源工作的中心环节,包括一般性状

134 植物学报 50(1) 2015 图1 俄罗斯蒲公英(A)(来自美国农业部种子库NSL219131)和短角蒲公英(B)(采集于新疆特克斯河谷)的植株形态比较 Figure 1 The phenotypic comparison of Taraxacum koksaghyz (A) (NSL219131) and T. brevicorniculatum (B) (collected from Tekes River, Zhaosu, Xinjiang) 不足, 德国科学家将蒲公英属短角蒲公英(T. brevi￾corniculatum)误当作俄罗斯蒲公英进行研究(Schmi￾dt et al., 2010a)。事实上, 短角蒲公英与俄罗斯蒲公 英野生生长区域重叠, 可能是俄罗斯蒲公英与四倍体 蒲公英属植物的杂交后代; 可无融合生殖; 叶呈倒披 针形, 羽状深裂, 叶色淡绿(图1); 其干根含胶量仅为 前者的1/4–1/2, 被认为是一种低劣的产胶植物(Shi et al., 2011; van Dijk and Lecoulant, 2012; Kir￾schner et al., 2013)。由于短角蒲公英生物量大、繁 殖能力强, 有利于橡胶草相关性状的遗传改良, 因此 备受育种专家关注。种质资源的定义是作物及其可遗 传物质的总和, 包括野生种、近缘植物、古老品种以 及改良品种等类型(韩振海, 2009)。蒲公英属植物大 多有乳管, 可产生胶乳, 且无生殖隔离(van Dijk et al., 1999)。因此广义上橡胶草种质资源可涵盖大多数 蒲公英属产胶植物, 包括俄罗斯蒲公英、短角蒲公英 以及西洋蒲公英(T. officinale)等。 1.2 橡胶草野生种质收集和保存 野生种质是橡胶草种质资源的主要类型。俄罗斯曾大 规模采集橡胶草野生种质进行种植驯化。美国、德国、 加拿大和澳大利亚等国也进行过短暂的引种试种。但 随着苏联解体和橡胶草被淘汰, 这些古老种质大多流 失。目前, 仅30余份俄罗斯蒲公英种质保存于俄罗斯 瓦维洛夫植物研究所, 1份可共享的种质(NSL219- 131)保存于美国农业部种子库。而短角蒲公英则在德 国卡尔斯鲁厄植物园、马尔堡大学、美国俄亥俄州立 大学OARDC以及荷兰KEYGENE公司等机构中均有 保存(Kirschner et al., 2013)。我国于1950年在新疆 自治区昭苏县特克斯河谷采得俄罗斯蒲公英, 其粗胶 含量为22.39%, 但无保存记录(林伯煌和魏小弟, 2009a)。近些年, 随着橡胶草研究的兴起, 橡胶草种 质缺乏的现状促使橡胶草野生种质资源的调查、收集 和保存工作重新开展。Volis等(2009)考察哈斯克斯坦 境内Kegen河流域, 发现俄罗斯蒲公英野生种质稀 少, 含胶量也远低于文献报道, 他们认为20世纪50年 代的过度采掘导致野生资源极度匮乏。相反, Kir￾schner研究组考察哈萨克斯坦Kegen-Sarydzhaz￾Tuzkel-Tekesg谷地后发现, 大量俄罗斯蒲公英野生 种群分布于潮湿高盐或干燥高盐低海拔区域, 其中大 种群(个体数量大于1 000)18个(van Dijk et al., 2010)。自1996年, 中国热带农业科学院、石河子大 学、北京化工大学和海南大学(李若霖, 2012)等单位 也相继对我国新疆地区橡胶草野生资源进行考察, 但 尚未见我国野生资源现状的报道。 1.3 橡胶草种质评价 种质评价是种质资源工作的中心环节, 包括一般性状

仇键等:橡胶草的研究进展135 记载和特定性状评价。橡胶草作为潜在产胶作物,其育种年限,定向改造或创造新品种、新类型。橡胶草 产胶能力是种质评价的核心问题,而含胶量测定是广组织培养和遗传转化较容易,这给其遗传改良注入了 泛采用的评价方法。早期橡胶草含胶量测定主要有折新的活力。Qu等(2014)将拟南芥PAP1( production of 断法( Kleinhenz et al,2010)和碱煮法(李增贵和程 anthocyanin pigment1)基因导入短角蒲公英中,获 溥,1954;林仲贤,1954)。这两种方法操作简易,但得高花青素含量的植株,以期增加橡胶草的附加值。 对植物破坏大,准确性偏低。目前,一种基于快速溶 Wahler等(2009)沉默乳管特异表达多酚氧化酶 剂萃取( accelerated solvent extraction)与傅立叶红(PPO)基因,促进了短角蒲公英排胶。 Van deenen 外光谱( FTIR analysis)的产胶植物含胶量测定法已经等(2013)在短角蒲公英乳管中过表达拟南芥ATP柠 建立( Suchat et al,2013),在尽量不破坏植株的前提檬酸裂解酶(AC凵)基因,増加流向橡胶合成的乙酰辅 下,可实现快速准确测定含胶量。该方法将为橡胶草酶A,从而大幅度提高转基因植物的产胶量。目前,橡 的高通量种质评价提供可能( Molenveld et al,胶草天然橡胶合成途径中的许多蛋白和酶基因均被 2010)。此外,一些农艺性状对橡胶草的开发利用也克隆出来,这为下一步进行橡胶草天然橡胶合成基因 非常重要,如总生物量、种子活力、根生物量、主根工程调控奠定了基础。 数、侧根数、菊糖含量等。 Ritter等(2010a)采用温室 和田间实验,比较不同来源橡胶草的根生物量、主根3橡胶草种苗繁育和栽培现状 数、主根长度,侧根数、莲座数、叶片数、叶片长和 叶片生物量等性状,对橡胶草种质的农艺性状进行评31种苗繁育 价,为育种提供参考。 种苗繁育是实现优质品种推广和进一步改良的基础, 2橡胶草种质改良 主要分为无性繁殖和有性繁殖两种方式。Levt和 Hamm(1943)曾对俄罗斯蒲公英种子采集保存、种子 种质改良是作物遗传育种研究的重要任务,杂交是育活力和发芽等方面进行过系统的研究,所获得的种子 种的一个重要手段。橡胶草种质改良始于20世纪纯度达90%以上,出苗率超过60%。为扩繁农业部种 40-50年代,曾培育出 Velikoalekseevskiy、No485和子库的俄罗斯蒲公英,美国俄亥俄州立大学建立了 四倍体 Navashin三个品种,干根产量达10thm2套橡胶草种子生产流程,包括半控制种植、人工授粉 Warmke,1945; CTenaHOB,1952)。美国在二战期间种子机械化采集和脱粒、Ⅹ-ray筛选等工序,截至 最好种质的含胶量为5%-6%,产量达110kghm22012年共生产种子2000多万颗( Kleinhenz et al, Whaley and Bowen,1947),但这些古老的品种并2010,2012)。由于有性繁殖需异花授粉,易受杂交污 未被保留下来。随着橡胶草硏究的复苏,其杂交育种染,因此橡胶草的有性种子繁殖不利于保持种苗的优 工作再次受到重视。 Kleinhenz等(2012)通过筛选高良性状和纯度。早在1930年,俄罗斯学者就注意到种 含胶量橡胶草个体,通过杂交获得120个含胶量大于子繁育的俄罗斯蒲公英根的大小和含胶量差异很大。 5%的单株后代。Cemy等(2010)则进行了更加广泛的此后,民巴耶夫和李森科发现橡胶草可通过根或茎冠 种间杂交,通过俄罗斯蒲公英、短角蒲公英、西洋蒲扦插进行无性繁殖,采用扦插繁殖不但能加速繁殖速 公英以及四倍体俄罗斯蒲公英(包括天然和秋水仙素度,而且扦插繁殖的橡胶草生长好,发育均一,根生 诱导的四倍体)等之间的2500组杂交,培育出大量物量是种子繁殖的2倍(罗士苇等,1951)。美国也有类 或生长旺盛、或无融合生殖的新种质,部分种质含胶似的报道( Whaley and Bowen,1947)。目前,橡胶草 量已达6%-7%。但俄罗斯蒲公英自交不亲和,不能组织培养也获得了成功(林伯煌和魏小弟,2009b;林 自花授粉产生稳定子代,需单株筛选,阻碍了其杂伯煌等,2009;罗成华等,2012),这将有利于橡胶草 交育种的进程。总体上橡胶草的杂交育种工作进展缓优良种质的扩繁和工厂化种苗生产。此外,通过俄罗 斯蒲公英的无融合生殖改良,这种无性种子繁殖在优 基因工程是一种新的遗传改良手段,可大大缩短良性状固定上具有优势,也将成为橡胶草种苗繁育的

仇键等: 橡胶草的研究进展 135 记载和特定性状评价。橡胶草作为潜在产胶作物, 其 产胶能力是种质评价的核心问题, 而含胶量测定是广 泛采用的评价方法。早期橡胶草含胶量测定主要有折 断法(Kleinhenz et al., 2010)和碱煮法(李增贵和程 溥, 1954; 林仲贤, 1954)。这两种方法操作简易, 但 对植物破坏大, 准确性偏低。目前, 一种基于快速溶 剂萃取(accelerated solvent extraction)与傅立叶红 外光谱(FTIR analysis)的产胶植物含胶量测定法已经 建立(Suchat et al., 2013), 在尽量不破坏植株的前提 下, 可实现快速准确测定含胶量。该方法将为橡胶草 的高通量种质评价提供可能 (Molenveld et al., 2010)。此外, 一些农艺性状对橡胶草的开发利用也 非常重要, 如总生物量、种子活力、根生物量、主根 数、侧根数、菊糖含量等。Ritter等(2010a)采用温室 和田间实验, 比较不同来源橡胶草的根生物量、主根 数、主根长度, 侧根数、莲座数、叶片数、叶片长和 叶片生物量等性状, 对橡胶草种质的农艺性状进行评 价, 为育种提供参考。 2 橡胶草种质改良 种质改良是作物遗传育种研究的重要任务, 杂交是育 种的一个重要手段。橡胶草种质改良始于20世纪 40–50年代, 曾培育出Velikoalekseevskiy、No485和 四倍体Navashin三个品种, 干根产量达10 t·hm–2 (Warmke, 1945; Степанов, 1952)。美国在二战期间 最好种质的含胶量为5%–6%, 产量达110 kg·hm–2 (Whaley and Bowen, 1947), 但这些古老的品种并 未被保留下来。随着橡胶草研究的复苏, 其杂交育种 工作再次受到重视。Kleinhenz等(2012)通过筛选高 含胶量橡胶草个体, 通过杂交获得120个含胶量大于 5%的单株后代。Černý等(2010)则进行了更加广泛的 种间杂交, 通过俄罗斯蒲公英、短角蒲公英、西洋蒲 公英以及四倍体俄罗斯蒲公英(包括天然和秋水仙素 诱导的四倍体)等之间的2 500组杂交, 培育出大量 或生长旺盛、或无融合生殖的新种质, 部分种质含胶 量已达6%–7%。但俄罗斯蒲公英自交不亲和, 不能 自花授粉产生稳定子代, 需单株筛选, 阻碍了其杂 交育种的进程。总体上橡胶草的杂交育种工作进展缓 慢。 基因工程是一种新的遗传改良手段, 可大大缩短 育种年限, 定向改造或创造新品种、新类型。橡胶草 组织培养和遗传转化较容易, 这给其遗传改良注入了 新的活力。Qiu等(2014)将拟南芥PAP1(production of anthocyanin pigment 1)基因导入短角蒲公英中, 获 得高花青素含量的植株, 以期增加橡胶草的附加值。 Wahler 等 (2009) 沉默乳管特异表达多酚氧化酶 (PPO)基因, 促进了短角蒲公英排胶。Van Deenen 等(2013)在短角蒲公英乳管中过表达拟南芥ATP柠 檬酸裂解酶(ACL)基因, 增加流向橡胶合成的乙酰辅 酶A, 从而大幅度提高转基因植物的产胶量。目前, 橡 胶草天然橡胶合成途径中的许多蛋白和酶基因均被 克隆出来, 这为下一步进行橡胶草天然橡胶合成基因 工程调控奠定了基础。 3 橡胶草种苗繁育和栽培现状 3.1 种苗繁育 种苗繁育是实现优质品种推广和进一步改良的基础, 主要分为无性繁殖和有性繁殖两种方式。Levitt和 Hamm(1943)曾对俄罗斯蒲公英种子采集保存、种子 活力和发芽等方面进行过系统的研究, 所获得的种子 纯度达90%以上, 出苗率超过60%。为扩繁农业部种 子库的俄罗斯蒲公英, 美国俄亥俄州立大学建立了一 套橡胶草种子生产流程, 包括半控制种植、人工授粉、 种子机械化采集和脱粒、X-ray筛选等工序, 截至 2012年共生产种子2 000多万颗(Kleinhenz et al., 2010, 2012)。由于有性繁殖需异花授粉, 易受杂交污 染, 因此橡胶草的有性种子繁殖不利于保持种苗的优 良性状和纯度。早在1930年, 俄罗斯学者就注意到种 子繁育的俄罗斯蒲公英根的大小和含胶量差异很大。 此后, 民巴耶夫和李森科发现橡胶草可通过根或茎冠 扦插进行无性繁殖, 采用扦插繁殖不但能加速繁殖速 度, 而且扦插繁殖的橡胶草生长好, 发育均一, 根生 物量是种子繁殖的2倍(罗士苇等, 1951)。美国也有类 似的报道(Whaley and Bowen, 1947)。目前, 橡胶草 组织培养也获得了成功(林伯煌和魏小弟, 2009b; 林 伯煌等, 2009; 罗成华等, 2012), 这将有利于橡胶草 优良种质的扩繁和工厂化种苗生产。此外, 通过俄罗 斯蒲公英的无融合生殖改良, 这种无性种子繁殖在优 良性状固定上具有优势, 也将成为橡胶草种苗繁育的

有效途径之 4.2基因组和蛋白组研究 32农艺栽培技术研究 为揭示橡胶草产胶遗传基础, KEYGEN科学家运用流 式细胞分析仪,确定俄罗斯蒲公英核型为2n=2×=16 俄罗斯和美国都曾开展过橡胶草的规模化种植,并摸基因组大小为1450Mb;短角蒲公英核型为 索出一套适合本国的栽培系统,包括种植地开垦、灌2n=3x=24,基因组为1210Mb;西洋蒲公英核型为 溉、除草、施肥、轮作以及收获等农艺栽培技术2n=2x=16,基因组为825Mb( van Dijk and Lecou Whaley and Bowen,1947;罗土第等,1951)。俄罗ant,2012) KEYGEN和 NEIKER共同完成了俄罗斯 斯科学家指出,富含矿质以及有机质(尤其是氮、磷)蒲公英遗传图谱的构建,共获得784个ALFP标记和 的土壤适于栽培橡胶草,而酸性灰质土中加入石灰能151个SSR标记,其中763个ALFP和57个SSR组成8 增大橡胶草的根产量及含胶量(罗士苇等,1951)。据个连锁群,定位了16个农艺性状( Ritter et al,2010b; 美国农业部“紧急天然橡胶计划”报道,橡胶草非常 Arias et al,2012)。此外, KEYGEN构建了西洋蒲公 适应美国北部的气候,在有机质土壤及有机质较多的英的10XBAC文库,并与明斯特大学和 Amplicon ex- 矿质土壤中均生长良好,可实现半机械化种植,但除 press合作完成了俄罗斯蒲公英8xBAC文库的构建。 草和收根仍需耗费大量人 Whaley and Bowen,利用短角蒲公英顺式-异戊烯转移酶(CPT)和SRPP基 1947)。因此,橡胶草农艺栽培技术研究将主要面向因序列,同源筛选出51个BAC(6.1M)进行 Roche 机械化和自动化栽培技术的研发。John研究组师选出454测序,发现西洋蒲公英中仅1个cP基因,即 咪草烟( mazethayr)、甲氧咪草烟( imazamox)和乙氧cPT1。俄罗斯蒲公英含有3个CPT基因,分别为CPT 氟草醚( oxyfluorfen)3种化学除草剂,对橡胶草种植过2a、cPT2b和CPT3,其中CPT2a和CPT2b是一对等 程中的杂草控制效果良好( Cardina et al,2012) 位基因,而CPT3有21bp的缺失。俄罗斯蒲公英含7 Munt等(2012)发现低NP比值和适当密植不但可增加个SRPP,而西洋蒲公英仅有5个,它们成基因簇分 根的生物量,而且能控制主根分枝,便于橡胶草根的布,其中7SRP,56与7 b sRPPz类似(anD 机械化采收。 and Lecoulant,2012)。在北美 PENRA项目资助下 内华达大学构建了俄罗斯蒲公英根EST文库,共获得 4橡胶草产胶生物学 4702个ESTs和3363个非重复序列EST:L|BEST 017559)。 Shintani等(2010)比较俄罗斯蒲公英前3个 4.1乳管和胶乳 月根表达的EST,获得11700个ESTs和7931个非重 与橡胶树类似,橡胶草的乳管为有节乳管,列成多个复序列(EST:L|BEST_024575,EST:L|BEST 同心圆环,同一环上的乳管彼此连通成为一个独立的024574)。目前,菊科基因组计划已获得西洋蒲公英 乳管体系(黄晓华和翟道道,1989)。在乳管细胞结构的41278个ESTs和15761个非重复序列(htt∥/com- 上,橡胶草冋样具有橡胶粒子,它是橡胶生物合成的 genomiCs. ucdavis. edu)。随着蒲公英植物基因组学 重要细胞器。电子扫描显微镜观察结果显示,俄罗斯研究的不断深入,大量基因信息的积累和分析将有助 蒲公英的橡胶粒子平均直径约为320nm,与巴西橡于对橡胶草产胶遗传基础的了解。 胶树相近。分子排阻色谱测定俄罗斯蒲公英根部的橡 近期,橡胶草的胶乳蛋白质组学研究已成为新的 胶平均分子量约为1300kDa,大于巴西橡胶(大约研究热点,尤其是橡胶粒子蛋白。 Van der Meer等 1000KDa) Mooibroek and Cornish,2000)。免疫交(2010)采用2 D LC-nano MS对不同俄罗斯蒲公英种 叉反应显示橡胶草的小橡胶粒子蛋白(〈SRPP)和橡胶质的胶乳蛋白进行定量和定性分析,共鉴定出355个 树胶乳SRPP即过敏原Hevb3)有较高的免疫相似性蛋白,包括异戊二烯异构酶(D)、法尼基转移酶 ( Cornish et al,2012)。表明蒲公英橡胶可能含有类FPP)和CPT、SRPP以及GTP结合蛋白( GTP-bind- 似的过敏源,因此不适用于医疗卫生用品,但可应用 ing protein)等橡胶粒子结合蛋白,初步建立了蛋白组 于轮胎、胶管、胶鞋等传统制造领域 成和橡胶合成的相关性。该研究组还通过流式细胞仪

136 植物学报 50(1) 2015 有效途径之一。 3.2 农艺栽培技术研究 俄罗斯和美国都曾开展过橡胶草的规模化种植, 并摸 索出一套适合本国的栽培系统, 包括种植地开垦、灌 溉、除草、施肥、轮作以及收获等农艺栽培技术 (Whaley and Bowen, 1947; 罗士苇等, 1951)。俄罗 斯科学家指出, 富含矿质以及有机质(尤其是氮、磷) 的土壤适于栽培橡胶草, 而酸性灰质土中加入石灰能 增大橡胶草的根产量及含胶量(罗士苇等, 1951)。据 美国农业部“紧急天然橡胶计划”报道, 橡胶草非常 适应美国北部的气候, 在有机质土壤及有机质较多的 矿质土壤中均生长良好, 可实现半机械化种植, 但除 草和收根仍需耗费大量人工(Whaley and Bowen, 1947)。因此, 橡胶草农艺栽培技术研究将主要面向 机械化和自动化栽培技术的研发。John研究组筛选出 咪草烟(imazethayr)、甲氧咪草烟(imazamox)和乙氧 氟草醚(oxyfluorfer)3种化学除草剂, 对橡胶草种植过 程中的杂草控制效果良好(Cardina et al., 2012)。 Munt等(2012)发现低N/P比值和适当密植不但可增加 根的生物量, 而且能控制主根分枝, 便于橡胶草根的 机械化采收。 4 橡胶草产胶生物学 4.1 乳管和胶乳 与橡胶树类似, 橡胶草的乳管为有节乳管, 列成多个 同心圆环, 同一环上的乳管彼此连通成为一个独立的 乳管体系(黄晓华和翟道道, 1989)。在乳管细胞结构 上, 橡胶草同样具有橡胶粒子, 它是橡胶生物合成的 重要细胞器。电子扫描显微镜观察结果显示, 俄罗斯 蒲公英的橡胶粒子平均直径约为320 nm, 与巴西橡 胶树相近。分子排阻色谱测定俄罗斯蒲公英根部的橡 胶平均分子量约为1 300 kDa, 大于巴西橡胶(大约 1 000 kDa)(Mooibroek and Cornish, 2000)。免疫交 叉反应显示橡胶草的小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶 树胶乳SRPP(即过敏原Hev b3)有较高的免疫相似性 (Cornish et al., 2012)。表明蒲公英橡胶可能含有类 似的过敏源, 因此不适用于医疗卫生用品, 但可应用 于轮胎、胶管、胶鞋等传统制造领域。 4.2 基因组和蛋白组研究 为揭示橡胶草产胶遗传基础, KEYGEN科学家运用流 式细胞分析仪, 确定俄罗斯蒲公英核型为2n=2x=16, 基因组大小为 1 450 Mb; 短角蒲公英核型为 2n=3x=24, 基因组为1 210 Mb; 西洋蒲公英核型为 2n=2x=16, 基因组为825 Mb(van Dijk and Lecou￾lant, 2012)。KEYGEN和NEIKER共同完成了俄罗斯 蒲公英遗传图谱的构建, 共获得784个ALFP标记和 151个SSR标记, 其中763个ALFP和57个SSR组成8 个连锁群, 定位了16个农艺性状(Ritter et al., 2010b; Arias et al., 2012)。此外, KEYGEN构建了西洋蒲公 英的10×BAC文库, 并与明斯特大学和Amplicon ex￾press合作完成了俄罗斯蒲公英8×BAC文库的构建。 利用短角蒲公英顺式-异戊烯转移酶(CPT)和SRPP基 因序列, 同源筛选出51个BAC(6.1 M)进行Roche 454测序, 发现西洋蒲公英中仅1个CPT基因, 即 CPT1。俄罗斯蒲公英含有3个CPT基因, 分别为CPT- 2a、CPT2b和CPT3, 其中CPT2a和CPT2b是一对等 位基因, 而CPT3有21 bp的缺失。俄罗斯蒲公英含7 个SRPP, 而西洋蒲公英仅有5个, 它们成基因簇分 布, 其中TkSRPP4, 5, 6与TbSRPP类似(van Dijk and Lecoulant, 2012)。在北美PENRA项目资助下, 内华达大学构建了俄罗斯蒲公英根EST文库, 共获得 4 702个ESTs和3 363个非重复序列(EST: LIBEST_ 017559)。Shintani等(2010)比较俄罗斯蒲公英前3个 月根表达的EST, 获得11 700个ESTs和7 931个非重 复序列 (EST: LIBE ST_024575, EST: LIBEST_ 024574)。目前, 菊科基因组计划已获得西洋蒲公英 的41 278个ESTs和15 761个非重复序列(http://com￾pgenomics.ucdavis.edu/)。随着蒲公英植物基因组学 研究的不断深入, 大量基因信息的积累和分析将有助 于对橡胶草产胶遗传基础的了解。 近期, 橡胶草的胶乳蛋白质组学研究已成为新的 研究热点, 尤其是橡胶粒子蛋白。Van der Meer等 (2010)采用2D LC-nano MS对不同俄罗斯蒲公英种 质的胶乳蛋白进行定量和定性分析, 共鉴定出355个 蛋白, 包括异戊二烯异构酶(IDI)、法尼基转移酶 (FPP)和CPT、SRPP以及GTP结合蛋白(GTP-bind￾ing protein)等橡胶粒子结合蛋白, 初步建立了蛋白组 成和橡胶合成的相关性。该研究组还通过流式细胞仪

仇键等:橡胶草的研究进展137 分析了橡胶粒子大小,确定其发育阶段,并运用5橡胶草研究中存在的问题 Q-TOF MS和荧光差异蛋白表达分析法(DIGE)分析 了橡胶粒子发育过程中的蛋白表达变化( van der 在 PENRA和 PEARLS项目的支持下,国外在橡胶草 Meer et al,2012)。 Wahler等(2012)对短角蒲公英不种质资源、栽培技术和产胶分子生物学等领域的研究 同胶乳组分的278个蛋白进行分离鉴定,结果表明胶 进展迅速,蒲公英橡胶展现出一定的市场前景。但橡 乳中含大量的脂类代谢以及转运相关蛋白,而橡胶合胶草作为产胶植物,还存在诸多的理论间题和技术难 成相关蛋白在不同组分中均有分布。黄荣辉等(2013) 题亟待解决 建立了胶乳蛋白提取和双向电泳法,为下一步蛋白质 种质资源 组学研究奠定了基础。 橡胶草种质定义不明确,种质资源匮乏,评价系统也 43天然橡胶的生物合成 不完善,极大地阻碍了橡胶草的种质改良。历史上橡 基因克隆方面, Schmidt等(2010a)克隆到5个短角蒲股草通常指俄罗斯蒲公英及其驯化品种,而种质的遗 公英SRP基因( TbSRPP1-5和3个CPT基因传单一性不利于橡胶草的遗传改良。近期,有学者预 ( BcPT1-3),发现 TbsRPP1-5与其它植物的SRP 测俄罗斯蒲公英与西洋蒲公英杂交每公顷可收获干 基因序列相似,均在胶乳中高表达。其中, TbSRPP3,根6-9t每公顷产胶量能达到1200-1800kgan 4,5在胶乳中的表达量显著高于其它组织。短角蒲公 Beilen and Poirier,2007a)。由此可见,拓展橡胶草 英CPT基因与橡胶树高度同源,同样在胶乳中高表种质资源类型,同时对橡胶草种质资源的产量相关性 达,其中 TbCPT1表达量最高,其次是 BcPT3,它们 状(含胶量和根生物量等)、农艺性状(根形态、生殖方 的表达量随植株生长发育而增加。此外,短角蒲公英式和耐密植性)、抗逆性抗旱、耐盐碱、耐寒冷及抗 的甲羟戊酸途径也已被解析,其中的酶基因均被克 病虫害等)以及副产品(菊糖、菊芋糖和纤维素等)等重 要性状进行系统评价,将有助于对新种质资源的挖掘 隆,如3羟基-3-甲基-戊二酸酰辅酶A合酶(HMGS) 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR、甲羟戊利用,加速橡胶草的种质创新。 酸激酶MVK以及D等 an deenen et al,2012王52遗传改良 启超等,2012;仇键等,2013)。在功能研究方面 Hillebrand等(2012)运用RNA抑制短角蒲公英中橡胶草遗传育种才刚起步,还处于野生种质驯化阶 SRPP的表达,导致橡胶粒子聚集和橡胶含量显著下段。野生种质生物量小、含胶量低且变异大,这成为 降,但对橡胶分子量影响不明显。 Collins-siva等制约橡胶草商业化的主要因素。因此,提高产胶能力 (2012)通过抑制俄罗斯蒲公英中 TKSRPR3的表达,和增加生物量是橡胶草遗传改良的主要目标,而一些 发现橡胶含量和聚合长度均明显下降。由此可见,农艺性状(如抗性、机械化生产相关)和副产物含量等 SRPP在橡胶粒子结构稳定和天然橡胶合成中均起重特性的改良对橡胶草商业化也具有重要意义。 要作用。此外,SRPP受ABA信号途径中的bZP转录 53栽培 因子调控,可能参与ABA介导的胁迫应答反应 ( Fricke et al,2013)。产胶植物cPT可催化异戊二烯早期研究中,俄罗斯和美国将橡胶草种植于肥沃土地 (PP)的长链聚合,一直被认为是天然橡胶合成调控上,以获得较高产量。考虑到粮食安全问题,这种栽 中的关键酶。 Schmidt等(2010b)硏究发现C尸T定位于培模式并不可取。事实上,野生橡胶草适应性较强, 橡胶粒子上。在酵母中,CPT1-3均具有合成长链聚异可广泛种植于热带、温带和寒带地区,在干旱、盐碱 戊烯醇能力和较高的PP亲和性。Post等(2012)沉默地条件下仍可生长良好。因此,发展橡胶草的荒地和 短角蒲公英乳管中的C尸T,不但显著抑制了乳管橡胶盐碱地等边际性土地种植非常必要。此外,研发生态 粒子形成和橡胶生物合成,还造成三萜类化合物和菊友好型和水土保护型种植系统也是今后橡胶草栽培 粉(nuin)的积累。 技术研究的重要方向

仇键等: 橡胶草的研究进展 137 分析了橡胶粒子大小, 确定其发育阶段, 并运用 Q-TOF MS和荧光差异蛋白表达分析法(DIGE)分析 了橡胶粒子发育过程中的蛋白表达变化(van der Meer et al., 2012)。Wahler等(2012)对短角蒲公英不 同胶乳组分的278个蛋白进行分离鉴定, 结果表明胶 乳中含大量的脂类代谢以及转运相关蛋白, 而橡胶合 成相关蛋白在不同组分中均有分布。黄荣辉等(2013) 建立了胶乳蛋白提取和双向电泳法, 为下一步蛋白质 组学研究奠定了基础。 4.3 天然橡胶的生物合成 基因克隆方面, Schmidt等(2010a)克隆到5个短角蒲 公 英 SRPP 基 因 (TbSRPP1–5) 和 3 个 CPT 基 因 (TbCPT1–3), 发现TbSRPP1–5与其它植物的SRPP 基因序列相似, 均在胶乳中高表达。其中, TbSRPP3, 4, 5在胶乳中的表达量显著高于其它组织。短角蒲公 英CPT基因与橡胶树高度同源, 同样在胶乳中高表 达, 其中TbCPT1表达量最高, 其次是TbCPT3, 它们 的表达量随植株生长发育而增加。此外, 短角蒲公英 的甲羟戊酸途径也已被解析, 其中的酶基因均被克 隆, 如3-羟基-3-甲基-戊二酸酰辅酶A合酶(HMGS)、 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、甲羟戊 酸激酶(MVK)以及IDI等(van Deenen et al., 2012; 王 启超等, 2012; 仇键等, 2013)。在功能研究方面, Hillebrand等 (2012)运 用 RNAi抑制短角蒲公英中 SRPP的表达, 导致橡胶粒子聚集和橡胶含量显著下 降, 但对橡胶分子量影响不明显。Collins-Silva等 (2012)通过抑制俄罗斯蒲公英中TkSRPP3的表达, 发现橡胶含量和聚合长度均明显下降。由此可见, SRPP在橡胶粒子结构稳定和天然橡胶合成中均起重 要作用。此外, SRPP受ABA信号途径中的bZIP转录 因子调控 , 可能参与 ABA 介导的胁迫应答反应 (Fricke et al., 2013)。产胶植物CPT可催化异戊二烯 (IPP)的长链聚合, 一直被认为是天然橡胶合成调控 中的关键酶。Schmidt等(2010b)研究发现CPT定位于 橡胶粒子上。在酵母中, CPT1–3均具有合成长链聚异 戊烯醇能力和较高的IPP亲和性。Post等(2012)沉默 短角蒲公英乳管中的CPT, 不但显著抑制了乳管橡胶 粒子形成和橡胶生物合成, 还造成三萜类化合物和菊 粉(inulin)的积累。 5 橡胶草研究中存在的问题 在PENRA和PEARLS项目的支持下, 国外在橡胶草 种质资源、栽培技术和产胶分子生物学等领域的研究 进展迅速, 蒲公英橡胶展现出一定的市场前景。但橡 胶草作为产胶植物, 还存在诸多的理论问题和技术难 题亟待解决。 5.1 种质资源 橡胶草种质定义不明确, 种质资源匮乏, 评价系统也 不完善, 极大地阻碍了橡胶草的种质改良。历史上橡 胶草通常指俄罗斯蒲公英及其驯化品种, 而种质的遗 传单一性不利于橡胶草的遗传改良。近期, 有学者预 测俄罗斯蒲公英与西洋蒲公英杂交每公顷可收获干 根6–9 t, 每公顷产胶量能达到1 200–1 800 kg(van Beilen and Poirier, 2007a)。由此可见, 拓展橡胶草 种质资源类型, 同时对橡胶草种质资源的产量相关性 状(含胶量和根生物量等)、农艺性状(根形态、生殖方 式和耐密植性)、抗逆性(抗旱、耐盐碱、耐寒冷及抗 病虫害等)以及副产品(菊糖、菊芋糖和纤维素等)等重 要性状进行系统评价, 将有助于对新种质资源的挖掘 利用, 加速橡胶草的种质创新。 5.2 遗传改良 橡胶草遗传育种才刚起步, 还处于野生种质驯化阶 段。野生种质生物量小、含胶量低且变异大, 这成为 制约橡胶草商业化的主要因素。因此, 提高产胶能力 和增加生物量是橡胶草遗传改良的主要目标, 而一些 农艺性状(如抗性、机械化生产相关)和副产物含量等 特性的改良对橡胶草商业化也具有重要意义。 5.3 栽培 早期研究中, 俄罗斯和美国将橡胶草种植于肥沃土地 上, 以获得较高产量。考虑到粮食安全问题, 这种栽 培模式并不可取。事实上, 野生橡胶草适应性较强, 可广泛种植于热带、温带和寒带地区, 在干旱、盐碱 地条件下仍可生长良好。因此, 发展橡胶草的荒地和 盐碱地等边际性土地种植非常必要。此外, 研发生态 友好型和水土保护型种植系统也是今后橡胶草栽培 技术研究的重要方向