第三节重组子的筛选与鉴定 遗传学检测法 物理检测法 核酸分子杂交检测法 四、免疫化学检测法 五、核酸序列分析及其他方法
第三节 重组子的筛选与鉴定 一、 遗传学检测法 二、 物理检测法 三、 核酸分子杂交检测法 四、免疫化学检测法 五、 核酸序列分析及其他方法
第三节重组子的筛选与鉴定 相关概念 转化子 导入外源基因DNA分子后能稳定存在的受体细胞; 重组子 含有重组DNA分子的转化子; 筛选和选择 经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后,获得所需的阳性 重组子的过程 筛选 通过某种特定的方法,如核酸杂交及免疫测定等从受体细胞群体 或基因文库中鉴定出阳性重组子的过程 选择 通过某种外加因素的辨别作用,呈现具有重组DNA分子的特定克 隆的方法
第三节 重组子的筛选与鉴定 相关概念 转化子 导入外源基因DNA分子后能稳定存在的受体细胞； 重组子 含有重组DNA分子的转化子； 筛选和选择 经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需的阳性 重组子的过程； 筛选 通过某种特定的方法，如核酸杂交及免疫测定等从受体细胞群体 或基因文库中鉴定出阳性重组子的过程； 选择 通过某种外加因素的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克 隆的方法
遗传学检测法 该方法要求克隆基因能够表达,并利用相应的基因突变型作为受 体细胞,当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表 型时,我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因。 优点:简便、快速,结果较可靠 缺点:基因必须表达并具有合适的受体细胞。 (一)根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 1.抗药性标记插入失活选择法 2.β-半乳糖苷酶显色反应选择法 (二)根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因,能够对大肠杆菌寄主菌株所具 有的突变体发生体内抑制或互补效应,从而使被转化的寄主细胞表现 出外源基因编码的表型特征
一、遗传学检测法 该方法要求克隆基因能够表达，并利用相应的基因突变型作为受 体细胞，当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表 型时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因。 优点：简便、快速，结果较可靠。 缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具 有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现 出外源基因编码的表型特征
遗传学检测法 (-)载体表型选择法 1抗药性标记及其插入失活 选择法 如:pBR322质粒上有两 个抗菌素抗性基因:Ter和 amp BRs (363 bases) 7r上有插入位点 Bamh I和 Sali Amp上有插入位点PstI
一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活 选择法 如：pBR322质粒上有两 个抗菌素抗性基因: Tetr和 Ampr 。 Tetr上有插入位点BamH I和 Sal I; Ampr上有插入位点Pst I
遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR32抗菌素标记选择 (1)四环素:抑制细菌生长,但不杀死细菌 (2)氨苄青霉素抗性基因:产生β-内酰胺酶,使 氨苄青霉素转变为青霉酮酸,使碘-青霉素指示液 (I2 KI-Aampicillin)(蓝灰色)褪色 (3)环丝氨酸:杀死生长的细菌,但不杀死停 止生长的细菌
一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322抗菌素标记选择 （1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因：产生-内酰胺酶，使 氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停 止生长的细菌