(③)吸附剂的活性与相对湿度对薄层色谱的影响：吸附剂的活性是由表面能与表面积决定的。表面 能越大，单位重量的表面积（比表面积越大，吸附力越大，即活性越高，反之，吸附力越小，活性越 低。如硅胶之所以有吸附力，是由于其表面含众多的硅醇基，硅醇基的活泼羟基及游离羟基与极性 化合物或不饱和化合物形成氢键。活泼型及游离型的硅醇基数目决定着硅胶的活性。硅醇基是亲水 性基团，很容易吸附水而成为水合硅醇基而失去活性。自制的薄层板在105~110°℃C烘干，就是使水 合硅醇基变为游离硅醇基而活化，反之，活化后的硅胶薄层板可以吸附大气中的水蒸气分子降低活 性。也就是说硅胶表面吸附水分的作用是可逆的，在不同的相对湿度下，可以达到不同程度的吸附 亚衡， 在相对湿度改变的情况下会重新达到新的吸附平衡， 而不论在此以前硅胶板是处于何种相 湿度状态。在日常实践中，当活化后的硅胶（或氧化铝）薄层板从干燥器中取出，从准备点样到展开 前，薄层板是暴露在实验室的大气中，薄层板的活性就取决于实验环境的相对湿度。其他条件相同 的情况下，相对湿度对色谱质量的影响是很明显的。通常认为薄层色谱的重现性差，薄层板处在不 同相对湿度下操作是主要的原因之 加厚从的层鉴别厚A需在相显度85%上展开 整个 色谱的分离度才有明显改善 赤芍与 在低湿度<30% 展开 不易区分 在高湿度(80%)下 展开，色谱的分离度提高，从而显示出两者的差异部分。相反，万应锭中熊胆的鉴别，必须在低湿 度下展开，方可达到较为满意的结果，在32%相对湿度下展开，熊胆中的各游离胆酸（包括处方中的 牛胆汁和人工牛黄的游离胆酸)，如胆酸、猪去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸，可以 清楚地加以辨认， 而在70%相对湿度下展开，色谱质量明显降低，难以辨别 n妇显度在80%心 上展开，则色谱面目全非。苍术正己烷提取物的薄层鉴别，相对湿度对分辨率影响也是很明显的 有些样品的成分和所选用的展开剂对相对湿度有较宽的适应能力 即对相对湿度的要求不甚严 大致在相对湿度30% 70% 境条 (温度和 相对湿度)恰好 适合的情况下，似乎不必控制条件也能把试验做好，但为了不同实验室之间及不同季节均可重现试 验结果，应尽可能在相对湿度可控的条件下展开为宜。至少必须记录试验时实际的相对湿度。 相对湿度的控制方法，可在双槽展开箱的一侧槽中加入适当浓度的硫酸，将点样后的薄层板放入 另一侧槽中，密闭放置15~30分钟，再加展开剂展开；另一种方法是在预先准备好的条件控制箱（状 如平卧式展开箱，内盛适当浓度的硫酸，或用大小适宜的干燥器)内进行。 控制相对湿度用的硫酸溶液如下表。 相对湿度 所需硫酸浓度(VW) 硫酸(ml)+水(ml) 32% 42% 58% 65 72% 88%68 100 57 100 39.5 100 34 100 275 100 10.8 100 硫酸：D=1.86(96%~97%) (4)溶剂蒸气在薄层色谱中的作用：薄层色谱与柱色谱的区别之一就是溶剂的蒸气相在展开箱中也 参与色谱展开而形成三维的层析过程，展开箱的气体空间在层析过程中起着重要的作用
(3)吸附剂的活性与相对湿度对薄层色谱的影响：吸附剂的活性是由表面能与表面积决定的。表面 能越大，单位重量的表面积(比表面积)越大，吸附力越大，即活性越高，反之，吸附力越小，活性越 低。如硅胶之所以有吸附力，是由于其表面含众多的硅醇基，硅醇基的活泼羟基及游离羟基与极性 化合物或不饱和化合物形成氢键。活泼型及游离型的硅醇基数目决定着硅胶的活性。硅醇基是亲水 性基团，很容易吸附水而成为水合硅醇基而失去活性。自制的薄层板在105～110℃烘干，就是使水 合硅醇基变为游离硅醇基而活化，反之，活化后的硅胶薄层板可以吸附大气中的水蒸气分子降低活 性。也就是说硅胶表面吸附水分的作用是可逆的，在不同的相对湿度下，可以达到不同程度的吸附 平衡，在相对湿度改变的情况下会重新达到新的吸附平衡，而不论在此以前硅胶板是处于何种相对 湿度状态。在日常实践中，当活化后的硅胶(或氧化铝)薄层板从干燥器中取出，从准备点样到展开 前，薄层板是暴露在实验室的大气中，薄层板的活性就取决于实验环境的相对湿度。其他条件相同 的情况下，相对湿度对色谱质量的影响是很明显的。通常认为薄层色谱的重现性差，薄层板处在不 同相对湿度下操作是主要的原因之一。如厚朴的薄层鉴别厚朴酚需在相对湿度85％以上展开，整个 色谱的分离度才有明显改善。赤芍与白芍在低湿度＜30％下展开，二者不易区分；在高湿度(80％)下 展开，色谱的分离度提高，从而显示出两者的差异部分。相反，万应锭中熊胆的鉴别，必须在低湿 度下展开，方可达到较为满意的结果，在32％相对湿度下展开，熊胆中的各游离胆酸(包括处方中的 牛胆汁和人工牛黄的游离胆酸)，如胆酸、猪去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸，可以 清楚地加以辨认，而在70％相对湿度下展开，色谱质量明显降低，难以辨别。如相对湿度在80％以 上展开，则色谱面目全非。苍术正己烷提取物的薄层鉴别，相对湿度对分辨率影响也是很明显的。 有些样品的成分和所选用的展开剂对相对湿度有较宽的适应能力，即对相对湿度的要求不甚严 格，大致在相对湿度30％～70％下得到相当稳定的色谱。有的样品在环境条件(温度和相对湿度)恰好 适合的情况下，似乎不必控制条件也能把试验做好，但为了不同实验室之间及不同季节均可重现试 验结果，应尽可能在相对湿度可控的条件下展开为宜。至少必须记录试验时实际的相对湿度。 相对湿度的控制方法，可在双槽展开箱的一侧槽中加入适当浓度的硫酸，将点样后的薄层板放入 另一侧槽中，密闭放置15～30分钟，再加展开剂展开；另一种方法是在预先准备好的条件控制箱(状 如平卧式展开箱，内盛适当浓度的硫酸，或用大小适宜的干燥器)内进行。 控制相对湿度用的硫酸溶液如下表。 相对湿度 所需硫酸浓度（V/V） 硫酸（ml） + 水（ml） 32% 42% 58% 65% 72% 88% 68 100 57 100 39.5 100 34 100 27.5 100 10.8 100 硫酸：D＝1.86(96%～97%) (4)溶剂蒸气在薄层色谱中的作用：薄层色谱与柱色谱的区别之一就是溶剂的蒸气相在展开箱中也 参与色谱展开而形成三维的层析过程，展开箱的气体空间在层析过程中起着重要的作用
通常所谓的"展开箱泡和"应该严格区分礼以下几种情况 展开箱饱和：是指展开前及展开中溶剂系统中所有组分在展开箱的整个气体空间达到平衡，即达 到饱和状态；但在日常的实践中，需要在"饱和"状态下展开的较少，而只需用展开剂（或规定的溶剂） 的蒸气在展开箱中预平衡一定时间，即所称的"预平衡 预吸附：通常是指薄层板的干燥板面（即未被溶剂湿润的部分）对展开箱空间气体分子的任何程度的 吸附，即所谓的"预饱和"、 吸附饱和：是指薄层板的未被溶剂湿润的部分与展开箱的饱和气体空间达到平衡状态，即"完全饱 和"，这是预吸附的极限状态。 毛细管饱和：是指薄层板所有的自由空隙借毛细管的作用被溶剂充满的过程，即相当于展开完成 后的状态。 饱和的情况与展开箱的类型有关，常用的平底展开箱在展开前较难达到展开箱饱和，所以通常的 做法是在内壁加贴与之等宽等高的用溶剂湿润的滤纸，有助于达到饱和。用双槽展开箱在其一侧槽 中加溶剂可以较容易达到吸附饱和及展开箱饱和。如用夹心式展开箱，由于箱内空间很小，展开前 因为空间没有溶剂分子 而且很难有 空间扩散 所以实际上是非饱和的 在这种非能 夹心式展 开箱中薄层板不产生预吸附现象。通常误认为夹心式展开箱空间小很容易饱和，其实只有在展开完 成后才达到胞和，但这时对层析村过程已不起作用 在常规薄层色谱分析中，预吸附和吸附饱和对层析过程有很大的 响。吸附剂表面的空间是很有 限的，当用多组分溶剂展开时，不同溶剂分子在吸附区相互竞争，发生"取代效应”，尤其在薄层板的 下部， 一个组分的等温吸附线会受到另外组分的性质和相对饱和程度的影响。如硅胶是亲水性吸附 剂，它首先对溶剂组分中的极性分子有更大的亲合力，所以在吸附平衡的过程中， 被吸附的各组分 的浓度比与气体空间的很不相同】 与溶剂的液相组成差别更大 可以想象在不加控制的情况下是 复杂的。简言之， 薄层板在 没有预吸附时，混合溶剂系统中的一部分溶剂分子有选择地 吸附在 层板面上而形成固定相，同时在板上形成溶剂梯度从而直接影响层析过程，溶剂的蒸气相、 液相和 固定相一起构成了一个作用机制复杂的三维层析过程. (⑤)关于薄层色谱的优化及溶剂系统（展开剂的选择：依靠色谱分离混合物质需要解决的主要问题 有两个：①相邻物质对的分离。②在一个宽极性范围内的多混合物的分离。就薄层色谱而言，解决 这两类不同的问题，所需要的优化技术是不同的。解决相邻物质对的分离，主要就两个相邻物质的 理化性质，考虑选用正相薄层板还是反相薄层板】 再考虑选用单， 组成的展开剂还是混合溶剂作展 开剂以及极性大小或酸碱性等 甚至考虑选用什么展开技术，如低R值的物质对可考虑用U型展于 箱，作径向展开等。对复杂混合物的分离，问题要复杂得多， 股即使采用了佛度展开技术，也不 大可能将在一个相当宽的极性范围内的多组分既解决它们的最大限度分离问题，又解决各个组分最 佳分离度的问题。就药典收载的品种，所采用的展开技术还是局限在常规的薄层展开技术，在其他 条件没有太多的选择的前提下， 溶剂系统，即展开剂的优选就成了主要需要解决的问题。 展开剂的洗怪和优化，主要考虑两个方面：溶剂的极性和溶剂的洗怪性。前者要求使欲分离的主 后者要求达到最佳的分离度。关于溶剂系统的优化，前人已做了 有不少文献专著作了介绍，较为常用的如年 优选法 溶剂强度法 三角形法 匀设计法及PRISM优选法等。由于中药成分很复杂，加上在常规展开箱中展开时，溶剂蒸气 相灯 湿度等因素的影响，各种优选方法似乎还难以将这些复杂的因素考虑在内，所以，展开剂在选择性 的优选方面，几乎还是依靠实验经验，中药分析更是如此。当然在实践中参考文献介绍的展开溶剂 的选择方法，以减少盲目性还是很必要的；可以期待更加科学更为实用的展开剂优选方法将被开发 和研究。 在比较和选用展开剂时，应该多作比较，不同的展开剂，分离效果有时相差很悬殊，这方面的例 子很多。同时在判断试验条件时，还不要忘记影响色谱质量的其他因素 (6)温度对薄层色谱的影响：在相对温度恒定的条件 船在高温度开时.R值宫：之 R值降低 不过 温度如相去 ±5C时 Rf 般不会超过0.02， 所以对层析行为影响不 大。但是展开时温度相差较大时，将不同程度地影响色谱的质量。如人参用氯仿-甲醇水 (65:35:10)的下层溶液，在较高室温(26℃)展开，得到的色谱与在较低室温(10℃)展开得到的色谱
通常所谓的"展开箱饱和"应该严格区分以下几种情况； 展开箱饱和：是指展开前及展开中溶剂系统中所有组分在展开箱的整个气体空间达到平衡，即达 到饱和状态；但在日常的实践中，需要在"饱和"状态下展开的较少，而只需用展开剂(或规定的溶剂) 的蒸气在展开箱中预平衡一定时间，即所称的"预平衡"。 预吸附：通常是指薄层板的干燥板面(即未被溶剂湿润的部分)对展开箱空间气体分子的任何程度的 吸附，即所谓的"预饱和"。 吸附饱和：是指薄层板的未被溶剂湿润的部分与展开箱的饱和气体空间达到平衡状态，即"完全饱 和"，这是预吸附的极限状态。 毛细管饱和：是指薄层板所有的自由空隙借毛细管的作用被溶剂充满的过程，即相当于展开完成 后的状态。 饱和的情况与展开箱的类型有关，常用的平底展开箱在展开前较难达到展开箱饱和，所以通常的 做法是在内壁加贴与之等宽等高的用溶剂湿润的滤纸，有助于达到饱和。用双槽展开箱在其一侧槽 中加溶剂可以较容易达到吸附饱和及展开箱饱和。如用夹心式展开箱，由于箱内空间很小，展开前 因为空间没有溶剂分子，而且很难有空间扩散，所以实际上是非饱和的。在这种非饱和的夹心式展 开箱中薄层板不产生预吸附现象。通常误认为夹心式展开箱空间小很容易饱和，其实只有在展开完 成后才达到饱和，但这时对层析过程已不起作用。 在常规薄层色谱分析中，预吸附和吸附饱和对层析过程有很大的影响。吸附剂表面的空间是很有 限的，当用多组分溶剂展开时，不同溶剂分子在吸附区相互竞争，发生"取代效应"，尤其在薄层板的 下部，一个组分的等温吸附线会受到另外组分的性质和相对饱和程度的影响。如硅胶是亲水性吸附 剂，它首先对溶剂组分中的极性分子有更大的亲合力，所以在吸附平衡的过程中，被吸附的各组分 的浓度比与气体空间的很不相同，与溶剂的液相组成差别更大。可以想象在不加控制的情况下是很 复杂的。简言之，薄层板在没有预吸附时，混合溶剂系统中的一部分溶剂分子有选择地被吸附在薄 层板面上而形成固定相，同时在板上形成溶剂梯度从而直接影响层析过程，溶剂的蒸气相、液相和 固定相一起构成了一个作用机制复杂的三维层析过程。 (5)关于薄层色谱的优化及溶剂系统(展开剂)的选择：依靠色谱分离混合物质需要解决的主要问题 有两个：①相邻物质对的分离。②在一个宽极性范围内的多混合物的分离。就薄层色谱而言，解决 这两类不同的问题，所需要的优化技术是不同的。解决相邻物质对的分离，主要就两个相邻物质的 理化性质，考虑选用正相薄层板还是反相薄层板，再考虑选用单一组成的展开剂还是混合溶剂作展 开剂以及极性大小或酸碱性等，甚至考虑选用什么展开技术，如低Rf值的物质对可考虑用U-型展开 箱，作径向展开等。对复杂混合物的分离，问题要复杂得多，一般即使采用了梯度展开技术，也不 大可能将在一个相当宽的极性范围内的多组分既解决它们的最大限度分离问题，又解决各个组分最 佳分离度的问题。就药典收载的品种，所采用的展开技术还是局限在常规的薄层展开技术，在其他 条件没有太多的选择的前提下，溶剂系统，即展开剂的优选就成了主要需要解决的问题。 展开剂的选择和优化，主要考虑两个方面：溶剂的极性和溶剂的选择性。前者要求使欲分离的主 要物质能在Rf值0.3～0.7的范围内，后者要求达到最佳的分离度。关于溶剂系统的优化，前人已做了 大量的工作，有不少文献专著作了介绍，较为常用的如单纯型优选法、溶剂强度法、三角形法、均 匀设计法及PRISM优选法等。由于中药成分很复杂，加上在常规展开箱中展开时，溶剂蒸气、相对 湿度等因素的影响，各种优选方法似乎还难以将这些复杂的因素考虑在内，所以，展开剂在选择性 的优选方面，几乎还是依靠实验经验，中药分析更是如此。当然在实践中参考文献介绍的展开溶剂 的选择方法，以减少盲目性还是很必要的；可以期待更加科学更为实用的展开剂优选方法将被开发 和研究。 在比较和选用展开剂时，应该多作比较，不同的展开剂，分离效果有时相差很悬殊，这方面的例 子很多。同时在判断试验条件时，还不要忘记影响色谱质量的其他因素。 (6)温度对薄层色谱的影响：在相对温度恒定的条件下，一般在较高温度展开时，Rf值高；反之， Rf值降低。不过，展开温度如相差±5℃时，Rf值变动一般不会超过±0.02，所以对层析行为影响不 大。但是展开时温度相差较大时，将不同程度地影响色谱的质量。如人参用氯仿-甲醇-水 (65∶35∶10)的下层溶液，在较高室温(26℃)展开，得到的色谱与在较低室温(10℃)展开得到的色谱
相比，分离效果和图谱面貌有很大差别。温度的影响首先在于展开剂中各有机溶剂因沸点、蒸气 压、蒸发数量、相对密度等不同而蒸发程度各异，因而在展开箱的空间分布的展开剂组成中各有机 溶剂的蒸气比例也发生变化，必然直接影响到欲分离物质的层析行为。 其次 由于温度的变化，含 水的两相展开剂在放置分层过程或展开时有机相中水的比例他不同，从而不同程度地改变了展开剂 的极性，结果影响到色谱的分离度。三七总皂苷的薄层鉴别，当用氯仿-甲醇-水(65：35：10)的下层 溶液作展开剂，在硅胶高效预制板(MERCK)上，于常温展开时，三七皂苷R1与人参皂苷Re不能分 开，只有在低于10℃下展开，才能将二者分离。 ()影响薄层色谱的其他因素：除上述主要影响因素外，操作技巧和熟练程度以及所用的器材溶剂 试剂等的质量也是不可忽视的影响薄层色谱质量的因素。如选用了不合规格的预制板，所得的图谱 是扭曲变形的色谱。 同样 手铺的自 板如板面不均匀 也不可能得到质量好的色谱 壁如用不合 格的手铺自制板所得到的人参皂苷的薄层色谱是 个难以辨认的图谱。 展开剂所用的溶剂质量不好，也直接影响薄层色谱的分离能力，如大黄的薄层色谱分析用的展开 剂中的甲酸乙酯，遇水容易引起水解，如用多次开瓶的残存溶剂， 因逐渐吸收大气中的水分而不同 程度地分解，所得的色谱与用新鲜的溶剂所得的色谱有明显的差别，即用了陈旧的甲酸乙酯作展开 剂组分，色谱中的原来可明显分离的五个葱醌苷元分离降低，芦荟大黄素与大黄酸已不能分开。所 以，在遇到意想不到的结果时，应多方面的检查原因。 三)高效液相色谱法 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流 动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离 后，依次进入金侧器，色谱信号由记录仪或积分议记录 1.对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填料和流动相的组分依供试品的 性质而定。常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛 基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃 微球等，用于分子排阻色谱等。 注样最 一般为数微升，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器 用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法对溶剂的要求。如依照药 对药材及其制 剂进行鉴别时，其固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，而如色谱柱内径、长 度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵 敏度等，均可适当改变以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。 一般色谱图约于20分钟内记 录完毕。 2.色谱条件与系统运用性试验对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调 整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子 (1)色谱柱的理论板数()：在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种规定的内标物质溶液，记录 色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和 半高峰宽Wh/2),按n=5.54tRWh/2)2i计 算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项 下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件如柱长，载体性能，色谱柱充填料的优劣等)，使 理论板数达到要求， (②)分离度：定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度， 如图6-2分离度(R)的十算公式为： R=2(tR2-tR1)/W1+W2 式中：R2为相邻两峰中后一峰的保留时间 tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间： W1及W2为相邻两峰的峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5. 图6-2计算分离度示意图
相比，分离效果和图谱面貌有很大差别。温度的影响首先在于展开剂中各有机溶剂因沸点、蒸气 压、蒸发数量、相对密度等不同而蒸发程度各异，因而在展开箱的空间分布的展开剂组成中各有机 溶剂的蒸气比例也发生变化，必然直接影响到欲分离物质的层析行为。其次，由于温度的变化，含 水的两相展开剂在放置分层过程或展开时有机相中水的比例也不同，从而不同程度地改变了展开剂 的极性，结果影响到色谱的分离度。三七总皂苷的薄层鉴别，当用氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)的下层 溶液作展开剂，在硅胶高效预制板(MERCK)上，于常温展开时，三七皂苷R1与人参皂苷Re不能分 开，只有在低于10℃下展开，才能将二者分离。 (7)影响薄层色谱的其他因素：除上述主要影响因素外，操作技巧和熟练程度以及所用的器材溶剂 试剂等的质量也是不可忽视的影响薄层色谱质量的因素。如选用了不合规格的预制板，所得的图谱 是扭曲变形的色谱。同样，手铺的自制板如板面不均匀，也不可能得到质量好的色谱，譬如用不合 格的手铺自制板所得到的人参皂苷的薄层色谱是一个难以辨认的图谱。 展开剂所用的溶剂质量不好，也直接影响薄层色谱的分离能力，如大黄的薄层色谱分析用的展开 剂中的甲酸乙酯，遇水容易引起水解，如用多次开瓶的残存溶剂，因逐渐吸收大气中的水分而不同 程度地分解，所得的色谱与用新鲜的溶剂所得的色谱有明显的差别，即用了陈旧的甲酸乙酯作展开 剂组分，色谱中的原来可明显分离的五个蒽醌苷元分离降低，芦荟大黄素与大黄酸已不能分开。所 以，在遇到意想不到的结果时，应多方面的检查原因。 (三)高效液相色谱法 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流 动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离 后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1．对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填料和流动相的组分依供试品的 性质而定。常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛 基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃 微球等，用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。当 用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法对溶剂的要求。如依照药典对药材及其制 剂进行鉴别时，其固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，而如色谱柱内径、长 度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵 敏度等，均可适当改变以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记 录完毕。 2．色谱条件与系统运用性试验 对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调 整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。 (1)色谱柱的理论板数(n)：在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种规定的内标物质溶液，记录 色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR(以分钟或长度计，下同，但应取相同单位)和 半高峰宽(Wh／2)，按n＝5.54(tRWh／2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项 下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件(如柱长，载体性能，色谱柱充填料的优劣等)，使 理论板数达到要求。 (2) 分离度：定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度， 如图6-2分离度(R)的计算公式为： R=2（tR2－tR1）/ W1＋W2 式中：tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为相邻两峰的峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。 图6-2 计算分离度示意图
(3)拖尾因子：为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子(T是否符合 各品种项下的规定，或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为： T=W0.05h/2d1 式中：W0.05h为0.05峰高处的峰宽： d1为峰极大至峰前沿之间的距离。 除另有规定外，T应在0.95~1.05间。也可按各种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%、 120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，分别注样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差 应不大于2.0%。 3.测定法定量测定时，可根据样品的具体情况采用峰面积法或峰高法。但用归一法或内标法测 定杂质总量时，须采用峰面积法。 (1)面积归一化法：测定供试品（或经衍生化处理的供试品）中各杂质及杂质的总量限度采用不加校 正因子的峰面积归一法。计算各杂质峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率。但溶剂峰不计 算在内。色谱图的记录时间应根据各品种所含杂质的保留时间决定，除另有规定外，可为该品种主 成分保留时间的倍数。 (2)主成分自身对照法：当杂质峰面积与成分峰面积相差悬殊时，采用主成分自身对照法。在测定 先按各品种规定的杂质限度，将供试品稀释成一 的灵敏度或进样量 度的溶液作为对照溶液进样，调 使对照溶液中的主成分色谱峰面积满足准 后取供试后 浴液 样，记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的倍数。根据测得的供试品溶液的各杂质峰面 积及其总和并和对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质限度。 (3)内标法测定供试品中杂质的总量限度：采用不加校正因子的峰面积法。 取供试品 ,按各品种的 性质选定合适的方法配制不含内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图1；再配制含有内标物 质的供试品溶液，在同样的条件下注样，已录色谱图川。己录的时间应为该品种的内标逢保留时间的 倍数，色谱图中内标峰高应为记录仪满标度的30%以上，否则应调整注样量或检测器灵敏度。 如果色谱图中没有与色谱图中内标峰保留时间相同的杂质蜂，则色谱图中各杂质峰面积之和应 小于内标物质峰面积（溶剂峰不计在内）。如果色谱图1中有与色谱图中内标物质峰保留时间相同的杂 质峰 应将色谱图上的内标物质峰面积减去色谱图中此杂质峰面积 即为内标物质峰的校正面 色谱图中各杂质峰总面积加色谱图中此杂质峰面积，即为各杂质峰的校正总面积，各杂质峰 的校正总面积应小于内标物质峰的校正面积。 (4)内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量：按各品种的规定，精密称（量）取对据 品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液，取一定量注入 仪器，记录色谱图，测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子： 校正因子0=As/ms Ar/mt 式中：As为内标物质的峰面积或峰高； A为对照品的峰面积或峰高； ms为加入内标物质的量 mt为加入对照品的量 再取各品种含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品（或淇杂质）峰和内标 物质的峰面积或峰高，按下式计算含量： Ax 含量(mx)=f×As/ms 式中：Ax为供试品（或其杂质）峰面积或峰高； mx为供试品（或其杂质）的量；
(3)拖尾因子：为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子(T)是否符合 各品种项下的规定，或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为： T＝W0．05h/2 d1 式中：W0．05h为0．05峰高处的峰宽； d1为峰极大至峰前沿之间的距离。 除另有规定外，T应在0.95～1.05间。也可按各种校正因子测定项下，配制相当于80％、100％、 120％的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，分别注样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差 应不大于2.0％。 3．测定法 定量测定时，可根据样品的具体情况采用峰面积法或峰高法。但用归一法或内标法测 定杂质总量时，须采用峰面积法。 (1)面积归一化法：测定供试品(或经衍生化处理的供试品)中各杂质及杂质的总量限度采用不加校 正因子的峰面积归一法。计算各杂质峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率。但溶剂峰不计 算在内。色谱图的记录时间应根据各品种所含杂质的保留时间决定，除另有规定外，可为该品种主 成分保留时间的倍数。 (2)主成分自身对照法：当杂质峰面积与成分峰面积相差悬殊时，采用主成分自身对照法。在测定 前，先按各品种规定的杂质限度，将供试品稀释成一定浓度的溶液作为对照溶液进样，调节检测器 的灵敏度或进样量，使对照溶液中的主成分色谱峰面积满足准确测量要求。然后取供试品溶液，进 样，记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的倍数。根据测得的供试品溶液的各杂质峰面 积及其总和并和对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质限度。 (3)内标法测定供试品中杂质的总量限度：采用不加校正因子的峰面积法。取供试品，按各品种的 性质选定合适的方法配制不含内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图Ⅰ；再配制含有内标物 质的供试品溶液，在同样的条件下注样，记录色谱图Ⅱ。记录的时间应为该品种的内标峰保留时间的 倍数，色谱图中内标峰高应为记录仪满标度的30％以上，否则应调整注样量或检测器灵敏度。 如果色谱图Ⅰ中没有与色谱图Ⅱ中内标峰保留时间相同的杂质蜂，则色谱图Ⅰ中各杂质峰面积之和应 小于内标物质峰面积(溶剂峰不计在内)。如果色谱图Ⅰ中有与色谱图Ⅱ中内标物质峰保留时间相同的杂 质峰，应将色谱图Ⅱ上的内标物质峰面积减去色谱图Ⅰ中此杂质峰面积，即为内标物质峰的校正面 积；色谱图Ⅱ中各杂质峰总面积加色谱图Ⅰ中此杂质峰面积，即为各杂质峰的校正总面积，各杂质峰 的校正总面积应小于内标物质峰的校正面积。 (4)内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量：按各品种的规定，精密称(量)取对照 品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液，取一定量注入 仪器，记录色谱图，测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子： 校正因子(f)＝ As/ms Ar/mt 式中：As为内标物质的峰面积或峰高； Ar为对照品的峰面积或峰高； ms为加入内标物质的量； mt为加入对照品的量。 再取各品种含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品(或其杂质)峰和内标 物质的峰面积或峰高，按下式计算含量： Ax 含量（mx）＝f × As/ms 式中：Ax为供试品(或其杂质)峰面积或峰高； mx为供试品(或其杂质)的量；
f、As和ms的意义同上. 当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，则 配制内标物质溶液不必精密称（量）取。 (5)外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量：按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供 试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的 峰面积或峰高，按下式计算含量： 含量(mx)=mr×Ax/A 式中各符号意义同上。 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定 量环进样为好 (四)柱色谱法 1.吸附柱色谱色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内 装入吸附剂。吸附剂的颗粒应尽可能保特大小均匀，以保证良好的分离效果。除另有规定外，通常 多采用直径为007 ,0.15mm的颗粒 色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，应 按各品种进行选择 (1吸附离的植结 ①干法将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加 入洗脱剂； 或在色 端出口处联接活塞，加入适量的洗 兄剂 旋开活塞使洗脱剂缓 出， 然 后自管]顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保 持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。②湿法将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去空气泡，徐徐倾入 色谱管中，然后加入洗脱剂将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平整。 埃道装吸附剂所用洗说剂从色谱柱自然流下，液面和柱表面相平对，即加供试品溶液 (2)供试品的加入：除另有规定外，将供试品溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中，再沿色谱管壁缓缓 加入，注意勿使吸附剂翻起。或将供试品溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发除 尽使呈松散状，加在已制备好的色谱柱上面。如供试品在常用溶剂中不溶，可将供试品与适量的吸 附剂在乳钵中研磨混匀后加入 (③)洗脱：除另有规定外，通常按洗脱剂洗脱能力大小递增变换洗脱剂的品种和比例份别分部收集 流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中应 保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。 2.分配柱色谱方法和吸附柱色谱基本一致。装柱前，先将载体和固定液混合，然后分次移入色 并用带有平面的玻棒压紧：供试品可溶于写 ,混以少量载体，加在预制好的色谱柱上 洗脱剂需先加固定液混合使之饱和，以避免洗脱过程中两相分配的改变 (五)气相色谱法 气相色谱法的流动相为气体，称为载气；色谱柱为填充柱和毛细管柱两种，填充柱内装吸附剂 高分子多孔小球或涂渍固定液的载体。毛细管柱内壁或载体经涂渍或交联固定液。注入进样口的供 试品被加热气化，并被载气带入色谱柱，在柱内各成分被分离后，先后进入检测器，色谱信号用记 录仪或数据处理器记录 1.对仪器的一般要求所用的仪器为气相色谱仪。除另有规定外，载气为氮气；色谱柱为填充柱 或毛细管柱，填充柱的材质为不锈钢或玻璃，载体用直径为0.25~0.18 018015mma成015 0.125 m经酸洗并硅烷化处理的硅 高分子多孔小球： 常用玻璃 或弹性石英毛细管柱的内径 为0.20或0.32mm. 进样口温度应高于柱温30~50℃，进样量一般不超过数微升；柱径越细进样量应 越少。检测器为氢火焰离子化检测器，检测温度一般高于柱温，并不得低于引00℃，以免水气凝结， 通常为250~350℃。各品种规定的条件，除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱柱材料不得 任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进 检测器的灵敏度等， 均可适当改变，以适应具体品种饼符合系统适用性试验的要求。 般色 谱图约于30分钟内记录完毕
f、As和ms的意义同上。 当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，则 配制内标物质溶液不必精密称(量)取。 (5)外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量：按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供 试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的 峰面积(或峰高)，按下式计算含量： 含量（mx）＝mr × Ax/Ar 式中各符号意义同上。 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定 量环进样为好。 (四)柱色谱法 1．吸附柱色谱 色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内 装入吸附剂。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果。除另有规定外，通常 多采用直径为0.07～0.15mm的颗粒。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，应 按各品种进行选择。 (1)吸附剂的填装：①干法 将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加 入洗脱剂；或在色谱管下端出口处联接活塞，加入适量的洗脱剂，旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出，然 后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保 持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。②湿法 将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去空气泡，徐徐倾入 色谱管中，然后加入洗脱剂将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平整。 俟填装吸附剂所用洗脱剂从色谱柱自然流下，液面和柱表面相平时，即加供试品溶液。 (2)供试品的加入：除另有规定外，将供试品溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中，再沿色谱管壁缓缓 加入，注意勿使吸附剂翻起。或将供试品溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发除 尽使呈松散状，加在已制备好的色谱柱上面。如供试品在常用溶剂中不溶，可将供试品与适量的吸 附剂在乳钵中研磨混匀后加入。 (3)洗脱：除另有规定外，通常按洗脱剂洗脱能力大小递增变换洗脱剂的品种和比例分别分部收集 流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中应 保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。 2．分配柱色谱 方法和吸附柱色谱基本一致。装柱前，先将载体和固定液混合，然后分次移入色 谱管中并用带有平面的玻棒压紧；供试品可溶于固定液，混以少量载体，加在预制好的色谱柱上 端。 洗脱剂需先加固定液混合使之饱和，以避免洗脱过程中两相分配的改变。 (五)气相色谱法 气相色谱法的流动相为气体，称为载气；色谱柱为填充柱和毛细管柱两种，填充柱内装吸附剂、 高分子多孔小球或涂渍固定液的载体。毛细管柱内壁或载体经涂渍或交联固定液。注入进样口的供 试品被加热气化，并被载气带入色谱柱，在柱内各成分被分离后，先后进入检测器，色谱信号用记 录仪或数据处理器记录。 1．对仪器的一般要求 所用的仪器为气相色谱仪。除另有规定外，载气为氮气；色谱柱为填充柱 或毛细管柱，填充柱的材质为不锈钢或玻璃，载体用直径为0.25～0.18mm、0.18～0.15mm或0.15 ～0.125mm经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球；常用玻璃或弹性石英毛细管柱的内径 为0.20或0.32mm。进样口温度应高于柱温30～50℃，进样量一般不超过数微升；柱径越细进样量应 越少。检测器为氢火焰离子化检测器，检测温度一般高于柱温，并不得低于l00℃，以免水气凝结， 通常为250～350℃。各品种规定的条件，除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱柱材料不得 任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进 样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并符合系统适用性试验的要求。一般色 谱图约于30分钟内记录完毕