45 kb BamHl BamHI Genomic DNA Sau3A sites Bacteriophage A vector Digest with BamHl Partial digest with Sau3A (BamH1-compatible) Isolate left and right arms Isolate 15-kb fragments. Discard smaller Cleaves a subset and larger fragments Ligate of all Sau3A sites Concatenate of many Left arm Right arm recombinant入phages Genomic DNA 15 kb ↓ In vitro cleavage of concatemer Package into phages Library of genomic Infect E.col DNA Plaques Screen library by using nucleic acid probe
3.CDNA文库 3.1cDNA克隆用的mRNA (1)mRNA的完整性 mRNA的大小：500bp-8kb,大部分1.5-2kb (2)mRNA的丰度 高丰度mRNA: 珠蛋白、免疫球蛋白、卵清蛋白 在特定细胞中占50-90% 低丰度mRNA: <0.5% 文库应足够大，鉴定和分离困难 (3)mRNA的富集（分离） oligo(dT)-纤维素、琼脂糖
3.1 cDNA克隆用的mRNA （1）mRNA的完整性 mRNA的大小：500 bp-8 kb，大部分1.5-2 kb （2）mRNA的丰度 高丰度mRNA： 珠蛋白、免疫球蛋白、卵清蛋白 在特定细胞中占50-90% 低丰度mRNA： <0.5% 文库应足够大，鉴定和分离困难 （3）mRNA的富集（分离） oligo（dT）-纤维素、琼脂糖 3. cDNA文库
3.2cDNA第一链的合成 ·反转录酶 AMV42℃M-MuLV37℃RNaseH ·引物 oligo(dT)12-18一般要求浓度高 模板 氢氧化甲基汞预处理，减弱链内二级结构 mRNA 5, AAAAAAAAAA 3 CDNA TTTTTTTTTT
3.2 cDNA第一链的合成 • 反转录酶 AMV 42℃ M-MuLV 37℃ RNaseH • 引物 oligo(dT)12-18 一般要求浓度高 • 模板 氢氧化甲基汞预处理，减弱链内二级结构 AAAAAAAAAA TTTTTTTTTT mRNA cDNA 5， 3
3.3cDNA第二链的合成 ·自身引导法 ·置换合成法
3.3 cDNA第二链的合成 • 自身引导法 • 置换合成法
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