第二节药物基因组学研究方法 药物基因组学研究的主要策略是选择药物作用与 体内过程相关的候选基因进行研究,鉴定基因序 列的变异。 早期的研究方法包括双生子法研究、系谱研究和 频数分布曲线法。目前常用研究方法主要分为: >表型分析法; 基因型分析法; O焦磷酸测序法 O基因芯片技术
第二节 药物基因组学研究方法 § 药物基因组学研究的主要策略是选择药物作用与 体内过程相关的候选基因进行研究，鉴定基因序 列的变异。 § 早期的研究方法包括双生子法研究、系谱研究和 频数分布曲线法。目前常用研究方法主要分为： Ø 表型分析法； Ø 基因型分析法； ¡焦磷酸测序法 ¡基因芯片技术
◆表型测定( phenotyping) ■表型( phenotype)又称性状,指个体形态、功能等 各方面的表现,如身高、血型、药物耐受等。 ■通过检测个体的代谢能力来间接分析其基因变异 选择某些药物代谢酶的特定底物作为探针药物,给予 受试者后收集一定时间的血液或尿液,采用HPLC等 手段分离测定血(尿)中原型药物和代谢物浓度; ■计算原型药物与代谢物摩尔浓度比值( Metabo|ic Ratio, MR) ■依据特定的分界点 antimode)将受试者区分为慢代谢 (PM)、中速代谢者(M)、快代谢者(∈EM)和极快代谢者 UM)。--CYP2D6 2017-12-3
2017-12-3 27 表型测定(phenotyping) n 表型（phenotype）又称性状，指个体形态、功能等 各方面的表现，如身高、血型、药物耐受等。 n 通过检测个体的代谢能力来间接分析其基因变异。 n 选择某些药物代谢酶的特定底物作为探针药物，给予 受试者后收集一定时间的血液或尿液，采用HPLC等 手段分离测定血(尿)中原型药物和代谢物浓度; n 计算原型药物与代谢物摩尔浓度比值(Metabolic Ratio, MR). n 依据特定的分界点(antimode)将受试者区分为慢代谢 (PM)、中速代谢者(IM)、快代谢者(EM)和极快代谢者 (UM)。---CYP2D6
◆基因分型( Genotyping) >通过提取受试者DNA而直接分析基因变异,可 以快速、准确地诊断出有药物代谢或受体活性 异常的个体,且结果终身不变。 常用的方法: ○聚合酶链反应( Polymerase Chain Reaction, PCR) O限制性片段长度多态性( RFLPS) ○焦磷酸测序 ○基因芯片技术
基因分型(Genotyping) Ø通过提取受试者DNA而直接分析基因变异，可 以快速、准确地诊断出有药物代谢或受体活性 异常的个体，且结果终身不变。 Ø常用的方法： ¡聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ， PCR) ¡限制性片段长度多态性(RFLPs) ¡焦磷酸测序 ¡基因芯片技术
PCR和RFLP检测CYP2D6*10B的原理图 人类基因组片断 CYPD8P CYP2D7 CYP2D6 cYP2D6基因 23456 fp cYP2D6基因片断 433bp HphI HphI *10B突变酶切位点 188 188 CYP2D6wt CYP2D6*10B
PCR和RFLP检测CYP2D6*10B的原理图 CYP2D8P CYP2D7 CYP2D6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 fp rp -82 351 433bp HphI HphI C T 188 188 CYP2D6wt CYP2D6*10B 人类基因组片断 CYP2D6基因 CYP2D6基因片断 *10B突变酶切位点
CYP2D6*10基因PCR扩增与RFLP 反应总体积50u ◆扩增步骤: dntP 200nmol/ Mg2+ 1. 25mmol/I 35cy cle 引物各1.0mmo Taq dna聚合酶05U 94c:94°℃ 10×PCR反应缓冲液 5min: 60se 72c:72°c 基因组DNA约30ng 52c/90sec: 7min gose 取扩增产物10μl,加入1μlHph(5U/μ),置37°C孵育16小时。 用3%琼脂糖凝胶进行电泳分析,紫外灯下观察产物片段长度
CYP2D6*10基因PCR扩增与RFLP § 反应总体积50μl § dNTP 200nmol/l § Mg2+ 1.25mmol/l § 引物各1.0mmol/l § Taq DNA聚合酶0.5U § 10×PCR反应缓冲液 § 基因组DNA约30ng 扩增步骤： 94℃ 5min 94℃ 60sec 52℃ 90sec 72℃ 90sec 72℃ 7min 35cycles 取扩增产物10μl，加入1l HphI (5 U/l)，置37C孵育16小时。 用3%琼脂糖凝胶进行电泳分析，紫外灯下观察产物片段长度