常,在ED途径中,第一个酶很活跃,而第一个和第二个酶常存在于戊糖循环途径中,当碳源 为碳水化合物时,第一个酶或第一个酶加第二个酶是常常会碰到的,但当所提供的碳源为乙 醇、有机酸、烷烃或其它基质时,微生物常回复到利用第三个酶参与 NADPH再生反应。在三 个连续的反应中所包含的另一个辅助基质为辅酶A,该辅酶在三个反应中为平衡自循环,如图 8-2-6所示。 COASH O-COASH E 2CH CSCOA EICH, CCH2 CSCOA CH3 CCH2 CSCOA NAdPH+Ht NAdP+ PHB 图8-2-6PHB生物合成过程中 COASH的循环 E1:3-酮硫解酶:F2:乙酰乙酰辅酶A还原酶:E3:P(3HA)合成酶 尽管在PHB合成途径的三个反应中,既不需要NAD也不需要ATP,但必须考虑包括PHB 生物合成途径在内的所有途径中 NAD/NADH和AIP/ADP的再生循环,这些辅助基质的缺乏 不可能使代谢中间产物顺利流动。在R. eutrophus中,包括AP和NAD的形成及 NADP/NADPH再循环的从葡萄糖通过ED途径转变成乙酰辅酶A,再形成PHB的生物合成 途径见图8-2-7 (Entner-Doudoroff Pathway) onate 6-phosphoglucono-o-lactone 2-keto-3-deoxyglucose-6D glyceroaldehyde-3B pyruvate NADPH +H NADP 2COASH NADH +H 2NADH + 2H 1, 3-bisphosphoglycerate 2acetyl-CoA COASH 3-phosphoglycerate acetoacetvI-COA- D-()-3-hydroxybutyryL-CoA CoASH 2-phosphoglycerate +ATP PHB ADP phosphoenolpyruvate 图8-2-7R. eutrophus以葡萄糖为碳源通过ED途径合成PHB的代谢过程 从该途径中可以很清楚地看出,NADP通过葡萄糖-6磷酸脱氢酶再生,细胞内PHB合成 的净反应如下 Glucose+(3p+1)ADP+(3p+1)P+(3/2)O2→(l/n)PHB+2CO2+3H2O+(3p+1)AIP(8-2-2) 式中p是PO比率,从该反应式中可以计算出PHB对基质葡萄糖的理论产率为 y=86180=048(gg) 总产率是从实际发酵过程中计算出来的,PHB在细胞生长停止后积累或部分在细胞生长
15 常，在 ED 途径中，第一个酶很活跃，而第一个和第二个酶常存在于戊糖循环途径中，当碳源 为碳水化合物时，第一个酶或第一个酶加第二个酶是常常会碰到的，但当所提供的碳源为乙 醇、有机酸、烷烃或其它基质时，微生物常回复到利用第三个酶参与 NADPH 再生反应。在三 个连续的反应中所包含的另一个辅助基质为辅酶 A，该辅酶在三个反应中为平衡自循环，如图 8-2-6 所示。 2CH3 CoASH CSCoA O CH3 O CCH2CSCoA O CH3CCH2CSCoA OH O CoASH E1 E 2 E 3 PHB PHB n n-1 NADP+ NADPH+H+ 图 8-2-6 PHB 生物合成过程中 CoASH 的循环 E1∶3-酮硫解酶；E2∶乙酰乙酰辅酶 A 还原酶；E3∶P(3HA)合成酶 尽管在 PHB 合成途径的三个反应中，既不需要 NAD+也不需要 ATP，但必须考虑包括 PHB 生物合成途径在内的所有途径中 NAD+ /NADH 和 ATP/ADP 的再生循环，这些辅助基质的缺乏 不可能使代谢中间产物顺利流动。在 R. eutrophus 中，包括 ATP 和 NAD+的形成及 NADP+ /NADPH 再循环的从葡萄糖通过 ED 途径转变成乙酰辅酶 A，再形成 PHB 的生物合成 途径见图 8-2-7。 6-phosphogluconate 6-phosphoglucono-δ-lactone glucose-6- 2-keto-3-deoxyglucose-6- glyceroaldehyde-3- 1,3-bisphosphoglycerate 3-phosphoglycerate 2-phosphoglycerate phosphoenolpyruvate ADP ATP NAD + Pi + NADH + H+ H O2 acetoacetyl-CoA 2pyruvate 2NAD 2NADH + 2H+ + 2acetyl-CoA CoASH ADP ATP 2CoASH 2CO2 NADPH + H+ NADP+ D-(-)-3-hydroxybutyryl-CoA CoASH PHB glucose ADP ATP P P P (Entner-Doudoroff Pathway) 图 8-2-7 R. eutrophus 以葡萄糖为碳源通过 ED 途径合成 PHB 的代谢过程 从该途径中可以很清楚地看出，NADP+通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶再生，细胞内 PHB 合成 的净反应如下： Glucose+(3p+1)ADP+(3p+1)Pi+(3/2)O2 (1/n)PHB+2CO2+3H2O+(3p+1)ATP (8-2-2) 式中 p 是 P/O 比率，从该反应式中可以计算出 PHB 对基质葡萄糖的理论产率为： ( ) / theor YP C =86/180=0.48 (g/g)。 总产率是从实际发酵过程中计算出来的，PHB 在细胞生长停止后积累或部分在细胞生长
的同时积累。假定所消耗的总碳量,(-△Smu),分成两部分,合成PHB所耗部分为(-△S1), 合成非PHB的菌体所消耗的部分为(-△S2),则有: (-△Sou)=(-△S1)+(-△S) (8-2-3) 因为PHB积累于细胞内部,因而总的菌体干重△Xta由两部分组成:即PHB部分(△P) 和非PHB的残留菌体部分(△XR),则有: Xota=△P+△X 因而,PHB的理论产率和总产率可分别定义为 Ye=△P/(-△S1) 同样,由基质(-△S2)所形成的残留菌体部分的产率Yxc,可表示为: AX,1-C,△P (8-2-7) △S 式中Cp为菌体中PHB占细胞干重的百分含量。 将(8-2-7)式和(8-2-6)代入(2-3)中可得: Ypirceor) Yprcor/Yxc+(1-Ypiceor/Yx) 根据式(828)可作出Ype/Ywe~CP的图,见图8-28 08 02 04 Cp [g PHB/g dry cell 图828Ym与Y、YxC和Cp的关系 从图828中可以看出,CP值越高,则ym越大,当然C总是比ypem小。真 养产碱杆菌在以葡萄糖、丁酸或H2、O2和CO2为基质时,胞内PHB含量为Cp一般不超过0.81, 图中Cp为081以上以虚线表示之。从图中还可以看出,Ym与Yxc有关,在前期的菌体 生长阶段,如果可获得较高的Yxc值,则细胞最终达到某一PHB含量时,就可相应得到较高 的p值。 (二)提高摇瓶发酵过程中PHB对葡萄糖的产率系数
16 的同时积累。假定所消耗的总碳量，(-△Stotal)，分成两部分，合成 PHB 所耗部分为(-△S1)， 合成非 PHB 的菌体所消耗的部分为(-△S2)，则有： (-△Stotal )=(-△S1)＋(-△S2) (8-2-3) 因为 PHB 积累于细胞内部，因而总的菌体干重△Xtotal 由两部分组成：即 PHB 部分(△P) 和非 PHB 的残留菌体部分(△XR)，则有： △Xtotal ＝△P＋△XR (8-2-4) 因而，PHB 的理论产率和总产率可分别定义为： ( ) / theor YP C =△P/(-△S1 ) (8-2-5) ( ) / overall YP C =△P/(-△Stotal ) (8-2-6) 同样，由基质(-△S2)所形成的残留菌体部分的产率 YX/C，可表示为： 2 2 / 1 S P C C S X Y P R P X C − − = − = (8-2-7) 式中 CP为菌体中 PHB 占细胞干重的百分含量。 将(8-2-7)式和(8-2-6)代入(2-3)中可得： Y Y C Y Y Y Y C P C overall P C theor P P C theor X C P C theor X C P / ( ) / ( ) / ( ) / / ( ) / / ( / ) = + 1− (8-2-8) 根据式(8-2-8)可作出 YP C Y overall P C theor / / / ～CP的图，见图 8-2-8。 Y (theor) p/c Yx/c = 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0.4 图 8-2-8 YP C overall / ( ) 与 YP / C (theor)、YX/C和 CP的关系 从图 8-2-8 中可以看出，CP 值越高，则 ( ) / overall YP C 越大，当然 ( ) / overall YP C 总是比 ( ) / theor YP C 小。真 养产碱杆菌在以葡萄糖、丁酸或 H2、O2 和 CO2 为基质时，胞内 PHB 含量为 CP一般不超过 0.81， 图中 CP为 0.81 以上以虚线表示之。从图中还可以看出， ( ) / overall YP C 与 YX/C有关，在前期的菌体 生长阶段，如果可获得较高的 YX/C值，则细胞最终达到某一 PHB 含量时，就可相应得到较高 的 ( ) / overall YP C 值。 (二)提高摇瓶发酵过程中 PHB 对葡萄糖的产率系数
从式(8-2-8)和上述的讨论中已经可以很清楚地看出,PHB发酵中产物对基质的产率系数 pe主要与残留菌体对基质的产率系数Yxc和最终胞内PHB含量CP有密切的关系,通过 分别提高Yxc和CP的值,就可以提高yem。 在PHB发酵过程中,前期主要为菌体繁殖阶段,如果在此阶段内细胞的比生长速 则细胞用于维持消耗所需的能量的比例增加,Yxc值就相应较小,导致最终的yp值变小。 因而,在菌体生长阶段,可采用定时补料的方式来降低某些高浓度基质可能造成的对菌体生 长的抑制作用,提高菌体的比生长速率,可获得较高的YxC值,以提高产物PHB对基质的产 率系数Ym。从表8-25中可以清楚地看到,当总糖浓度较低(4%)时,定时补料方式对提 高糖对PHB的产率系数不明显,随着总糖浓度的提高,定时补料方式可明显提高糖对PHB的 产率系数,这可能是因为在总糖浓度较高的情况下,采用一次投料操作时,高的初糖浓度会 对菌体的生长产生明显的抑制作用,使菌体的比生长速率下降,导致YxC降低,而采用定时 补料操作时,可以降低初糖浓度,减少高糖浓度对菌体生长的抑制作用,提高Yxc的值:且 采用定时补料操作方式时,胞内PHB的含量也可相应提高,从而提高了最终PHB对葡萄糖的 产率系数yrm。另外,菌体比生长速率的提高,可缩短前期菌体生长阶段所需的时间,有 利于提高PHB的生产强度:而胞内PHB含量的提高,也有利于PHB的后处理过程。 第三节真氧产碱杆菌连续培养动力学及二级连续培养系统生产聚羟基丁酸 、引言 真养产碱杆菌由于具有生长快、易培养和胞内多聚物含量高的特点,已被ICI公司用于PHB 和PHBV的工业化生产。早在20世纪60年代,已有学者对 R. eutrophus利用H、O2和CO2为基质 的连续培养动力学进行了研究,但以葡萄糖为基质所进行的相关研究报道几乎没有。此外 采用分批培养法和流加发酵法来生产PHB的报道很多,而采用连续培养法生产PHB的报道却很 少。我们以葡萄糖为限制性基质,对稳态条件下R. eutrophus WSH3的各种动力学特征进行了 研究,考察了该菌株的生长和PHB生产性能。在此基础上,针对PHB的形成特点,建立了一个 二级连续培养系统用于生产PHB,并优化了系统运行的工艺条件。 真养产碱杆菌一级连续培养动力学 (一)真养产碱杆菌在连续培养中的操作特征 从图8-3-1、8-3-2中可以看出,在稀释率为0075h1和0.15h时,细胞培养经过约3-5个停 留时间可达到稳态。其中残留菌体浓度是指菌体总干重中除去PHB含量后的剩余部分,这一参 数可真正反映菌体的生长变化情况
17 从式(8-2-8)和上述的讨论中已经可以很清楚地看出，PHB 发酵中产物对基质的产率系数 ( ) / overall YP C 主要与残留菌体对基质的产率系数 YX/C和最终胞内 PHB 含量 CP有密切的关系，通过 分别提高 YX/C和 CP的值，就可以提高 ( ) / overall YP C 。 在 PHB 发酵过程中，前期主要为菌体繁殖阶段，如果在此阶段内细胞的比生长速率较小， 则细胞用于维持消耗所需的能量的比例增加，YX/C值就相应较小，导致最终的 ( ) / overall YP C 值变小。 因而，在菌体生长阶段，可采用定时补料的方式来降低某些高浓度基质可能造成的对菌体生 长的抑制作用，提高菌体的比生长速率，可获得较高的 YX/C值，以提高产物 PHB 对基质的产 率系数 ( ) / overall YP C 。从表 8-2-5 中可以清楚地看到，当总糖浓度较低(4 %)时，定时补料方式对提 高糖对 PHB 的产率系数不明显，随着总糖浓度的提高，定时补料方式可明显提高糖对 PHB 的 产率系数，这可能是因为在总糖浓度较高的情况下，采用一次投料操作时，高的初糖浓度会 对菌体的生长产生明显的抑制作用，使菌体的比生长速率下降，导致 YX/C 降低，而采用定时 补料操作时，可以降低初糖浓度，减少高糖浓度对菌体生长的抑制作用，提高 YX/C 的值；且 采用定时补料操作方式时，胞内 PHB 的含量也可相应提高，从而提高了最终 PHB 对葡萄糖的 产率系数 ( ) / overall YP C 。另外，菌体比生长速率的提高，可缩短前期菌体生长阶段所需的时间，有 利于提高 PHB 的生产强度；而胞内 PHB 含量的提高，也有利于 PHB 的后处理过程。 第三节 真氧产碱杆菌连续培养动力学及二级连续培养系统生产聚羟基丁酸 一、引言 真养产碱杆菌由于具有生长快、易培养和胞内多聚物含量高的特点，已被ICI公司用于PHB 和PHBV的工业化生产。早在20世纪60年代，已有学者对R. eutrophus利用H2、O2和CO2为基质 的连续培养动力学进行了研究，但以葡萄糖为基质所进行的相关研究报道几乎没有。此外， 采用分批培养法和流加发酵法来生产PHB的报道很多，而采用连续培养法生产PHB的报道却很 少。我们以葡萄糖为限制性基质，对稳态条件下R. eutrophus WSH3的各种动力学特征进行了 研究，考察了该菌株的生长和PHB生产性能。在此基础上，针对PHB的形成特点，建立了一个 二级连续培养系统用于生产PHB，并优化了系统运行的工艺条件。 二、真养产碱杆菌一级连续培养动力学 (一)真养产碱杆菌在连续培养中的操作特征 从图8-3-1、8-3-2中可以看出，在稀释率为0.075 h-1和0.15 h-1时，细胞培养经过约3-5个停 留时间可达到稳态。其中残留菌体浓度是指菌体总干重中除去PHB含量后的剩余部分，这一参 数可真正反映菌体的生长变化情况
图8-3-1稀释率为0.075h1的过程曲线 图8-3-2稀释率为0.15h的过程曲线 O细胞干重口残留菌体浓度◇PHB含量△葡萄糖浓度 (二)残留菌体浓度、基质浓度与稀释率的关系 如图8-3-3所示,当D在0.05h至021h之间时,残留菌体浓大于o度随着D的增加而增加 在D为021h1时,残留菌体浓度达到最大值为262g/L,当D21h时,残留菌体浓度随D的增 加而快速下降,至D为04h时,残留菌体浓度仅为86g/,比D为02h1时的残留菌体浓度下 降了67.2 当D小于0.15h时,葡萄糖浓度未检出,当D大于040h-时,葡萄糖浓度急剧上升,此时 残留菌体浓度的下降也很快,说明该点已接近洗出点。 图8-3-3残留菌体浓度、基质浓度与稀释率的变化关系 ■残留菌体浓度十葡萄糖浓度 (三)胞内PHB含量、PHB浓度与稀释率的关系 如图8-3-4所示,随着D的增加,胞内PHB含量和PHB浓度均不断下降,胞内PHB含量从D 为005h时的95%下降至D为04h1时的27%;PHB浓度也从217gL下降至020g/L Morinaga利用H2、O2和CO2为基质连续培养R. eutrophus时,发现在溶氧限制的稳态条件下 随着D的增加,胞内PHB含量不断下降,认为这是由于较高的菌体比生长速率下,NAD(P)H被 迅速氧化所致。我们则认为在较高的比生长速率下,三羧酸循环途径中各个酶的活性很高, 乙酰辅酶A有效地进入三羧酸循环进行氧化,形成各种合成菌体所需的氨基酸等中间代谢产 物,使得用于合成PHB的中间产物一乙酰辅酶A的浓度很低,同时三羧酸循环所产生的高浓度 COASH强烈抑制了PHB合成途径中β-酮基硫解酶的活性,因而使PHB的合成途径受阻,造成所 合成的PHB量减少 0.0.5020.250.30.350.4 图8-3-4胞内PHB含量、PHB浓度与稀释率的关系 PHB含量■PHB浓度 (四)残留菌体的生产强度、PHB的生产强度与稀释率的变化关系
18 图8-3-1 稀释率为0.075 h-1的过程曲线 图8-3-2 稀释率为0.15 h -1的过程曲线 ○ 细胞干重 □ 残留菌体浓度 ◇ PHB含量 △ 葡萄糖浓度 (二)残留菌体浓度、基质浓度与稀释率的关系 如图8-3-3所示，当D在0.05 h-1至0.21 h-1之间时，残留菌体浓大于0度随着D的增加而增加， 在D为0.21 h-1 时，残留菌体浓度达到最大值为26.2 g/L，当D.21 h-1时，残留菌体浓度随D的增 加而快速下降，至D为0.4 h-1时，残留菌体浓度仅为8.6 g/L，比D为0.21h-1时的残留菌体浓度下 降了67.2 % 当D小于0.15 h -1时，葡萄糖浓度未检出，当D大于0.40 h-1时，葡萄糖浓度急剧上升，此时 残留菌体浓度的下降也很快，说明该点已接近洗出点。 Ｄ （ ） （ ） （h-1） 图8-3-3 残留菌体浓度、基质浓度与稀释率的变化关系 ■ 残留菌体浓度 ＋ 葡萄糖浓度 (三)胞内 PHB 含量、PHB 浓度与稀释率的关系 如图8-3-4所示，随着D的增加，胞内PHB含量和PHB浓度均不断下降，胞内PHB含量从D 为0.05 h-1时的9.5 %下降至D为0.4 h -1时的2.7 %；PHB浓度也从2.17 g/L下降至0.20 g/L。 Morinaga利用H2、O2和CO2为基质连续培养R. eutrophus 时，发现在溶氧限制的稳态条件下， 随着D的增加，胞内PHB含量不断下降，认为这是由于较高的菌体比生长速率下，NAD(P)H被 迅速氧化所致。我们则认为在较高的比生长速率下，三羧酸循环途径中各个酶的活性很高， 乙酰辅酶A有效地进入三羧酸循环进行氧化，形成各种合成菌体所需的氨基酸等中间代谢产 物，使得用于合成PHB的中间产物─乙酰辅酶A的浓度很低，同时三羧酸循环所产生的高浓度 CoASH强烈抑制了PHB合成途径中-酮基硫解酶的活性，因而使PHB的合成途径受阻，造成所 合成的PHB量减少。 Ｄ （ ） （h-1） （ ） 图8-3-4 胞内PHB含量、PHB浓度与稀释率的关系 ＊ PHB含量 ■ PHB浓度 (四)残留菌体的生产强度、PHB 的生产强度与稀释率的变化关系
如图8-3-5所示,当D为005h至0.225h时,随着D的增加,残留菌体的生产强度(Pk)不 断增加,至D为0.25h时,Pk达到最大值为569g(Lh)。D继续增加时,其值不断下降, 至D为04h时,P仅为344g(Lh),比最大时下降了395%。当D为005h1至021h1时,PHB 的生产强度(PB)也随着D的增加而增加,至D为021h时达到最大为019g/(Lh),随后不断下 降,至D为04h时,下降至0.08g/Lh) 0050.10.15 025030.35 图8-3-5残留菌体的生产强度、PHB的生产强度与稀释率的变化关系 ◆残留菌体生产强度×PHB生产强度 (五)残留菌体对底物的产率系数、产物对残留菌体的产率系数与稀释率的关系 如图8-3-6所示,当D在0.05h至0.21h的范围内,随着D的增加,YRs不断增加,YRBs 从D为0.05h时的040g/g,增至D为0.21h时的最大值为0.53g/g。当D继续增加时,YRBs开 始下降,当D为0.30h和040h时,Ys仅分别为0.37gg和0.36gg。可见在D较小和较大的 情况下,YRBs会随着D的减小或增大而大幅度下降,这是因为当D较小时,菌体的比生长速率 较小,此时,维持代谢所消耗底物的比例增加,达到不可忽略的程度;而当D较大时,在供氧 速率不足的情况下,可能会有某些其它代谢产物产生和积累,使得转化率下降 图8-3-6残留菌体对底物的产率系数和产物对残留菌体的产率系数与稀释率的关系 RB/S YP/RI 从图8-3-6中还可以看出,随着D的增大,YPR不断下降,即当菌体的比生长速率不断增 大时,单位菌体合成PHB的能力却不断下降。 Senior在研究氮源限制下的R. eutrophus的连续 培养时也发现,单位细胞物质所产生的聚合物(PHB)的量随生长速率的增加而减少 (六)基质消耗比速与稀释率的关系 如图8-3-7所示,基质消耗比速随着D的增加而不断增加,σ从D为0.05h4时的0.13h增至 D为04h1时的0.71hl。当D处于0.05h1至0.225h之间,o几乎呈线性增加,经回归发现两者 之间的变化关系符合下列方程:
19 如图8-3-5所示，当D为0.05 h-1至0.225 h-1时，随着D的增加，残留菌体的生产强度(PRB)不 断增加，至D为0.225 h-1 时，PRB达到最大值为 5.69 g/(Lh)。D继续增加时，其值不断下降， 至D为0.4 h-1时，PRB仅为3.44 g/(Lh)，比最大时下降了39.5%。当D为0.05 h-1至0.21 h-1时，PHB 的生产强度(PPHB)也随着D的增加而增加，至D为0.21 h-1时达到最大为0.19 g/(Lh)，随后不断下 降，至D为0.4 h-1时，下降至0.08 g/(Lh)。 -1 Ｄ（h ） 图8-3-5 残留菌体的生产强度、PHB的生产强度与稀释率的变化关系 ◆ 残留菌体生产强度 × PHB生产强度 (五)残留菌体对底物的产率系数、产物对残留菌体的产率系数与稀释率的关系 如图8-3-6所示，当D在0.05 h-1至0.21 h-1的范围内，随着D的增加，YRB/S不断增加，YRB/S 从D为0.05 h -1时的0.40 g/g，增至D为0.21 h -1时的最大值为0.53 g/g。当D继续增加时，YRB/S开 始下降，当D为0.30 h -1和0.40 h-1时，YRB/S仅分别为0.37 g/g和0.36 g/g。可见在D较小和较大的 情况下，YRB/S会随着D的减小或增大而大幅度下降，这是因为当D较小时，菌体的比生长速率 较小，此时，维持代谢所消耗底物的比例增加，达到不可忽略的程度；而当D较大时，在供氧 速率不足的情况下，可能会有某些其它代谢产物产生和积累，使得转化率下降。 Ｄ -1 （h ） （ ） （ ） 图8-3-6 残留菌体对底物的产率系数和产物对残留菌体的产率系数与稀释率的关系 YRB/S YP/RB 从图8-3-6中还可以看出，随着D的增大，YP/RB不断下降，即当菌体的比生长速率不断增 大时，单位菌体合成PHB的能力却不断下降。Senior在研究氮源限制下的R. eutrophus 的连续 培养时也发现，单位细胞物质所产生的聚合物(PHB)的量随生长速率的增加而减少。 (六)基质消耗比速与稀释率的关系 如图8-3-7所示，基质消耗比速随着D的增加而不断增加，从D为0.05 h-1时的0.13 h-1增至 D为0.4 h-1时的0.71 h-1。当D处于0.05 h-1至0.225 h-1之间，几乎呈线性增加，经回归发现两者 之间的变化关系符合下列方程：