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《发酵工程》课程教学资源（讲义）第八章聚羟基烷酸酯发酵过程优化

第一节聚羟基烷酸酯发酵概述第二节真养产碱杆菌生产PHB摇瓶发酵条件的研究第三节真氧产碱杆菌连续培养动力学及二级连续培养系统生产聚羟基丁酸第四节聚羟基丁酸分批发酵过程动力学模型及优化第五节聚羟基丁酸流加发酵条件研究第六节聚羟基丁酸双底物流加发酵准优化控制策略第七节羟基丁酸与羟基戊酸共聚物发酵条件的优化

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10 接种量 / %(v/v) 1 3 5 8 10 细胞干重 / gL -1 8.7 10.4 12.1 13.9 14.3 PHB 含量 / %(w/w) 57.3 65.8 70.2 77.1 76.2 PHB 浓度 / gL -1 5.0 6.8 8.5 10.7 10.9 注:初糖浓度为 3 %, 初始硫酸铵浓度为 0.2 %, 发酵时间为 40 h. (三)不同初始 pH 对菌体生长和 PHB 合成的影响如图 8-2-1 所示。可以看出，pH 值在 6.6～7.2 的范围内，对菌体细胞的生长影响不很明显，而当 pH 值大于 7.2 时，细胞的生长明显受到影响。pH 的变化对胞内 PHB 的积累影响较大。在 pH 值为 7.0 时，细胞干重和 PHB 的含量均达到最大值，在 pH 值偏高或偏低时，胞内 PHB 含量明显下降。因而，如能在发酵过程中控制较佳的 pH 值，可使细胞干重和胞内 PHB 含量都达到较高水平。细胞干重 PHB 产量胞内PHB含量量含量产重干胞细 p H 图 8-2-1 不同初始 pH 对菌体生长和 PHB 合成的影响注：初始葡萄糖浓度为 4 %，硫酸铵浓度为 0.25 %，发酵时间为 40 h。 (四)不同氮源浓度对菌体生长和产物合成的影响见表 8-2-3。在一定初始葡萄糖浓度下，过高的初始硫酸铵浓度不仅会抑制菌体细胞的生长，还会使最终 PHB 含量下降。硫酸铵浓度分别为 0.2 %和 0.3 %时，两者所得到的细胞干重和 PHB 浓度都比较接近，但硫酸铵浓度为 0.3 %时，胞内 PHB 含量相对较低。初糖浓度为 4 % 时，选择初始硫酸铵浓度为 0.2 %可以获得较高的 PHB 浓度和 PHB 含量。若为提高产物浓度而增加硫酸铵浓度时，初始葡萄糖浓度也应相应提高，否则会导致最终 PHB 含量的下降。表 8-2-3 初始硫酸铵浓度对菌体生长和 PHB 积累的影响硫酸铵浓度 / % 细胞干重 / gL -1 PHB 浓度/ gL -1 PHB 含量 / % 0.1 12.1 9.6 79.6 0.2 16.7 13.4 80.3 0.3 19.5 13.7 70.2 0.4 18.1 11.3 61.5 0.5 16.6 8.9 53.7 注∶发酵时间为 40 h，初糖浓度为 4 %。从真养产碱杆菌形成 PHB 的机制可知，菌体细胞的生长和 PHB 的积累对氮源浓度的要求不一样。细胞的生长需要有丰富的氮源存在，相反只有当培养基中氮源浓度很低或缺乏时

才能刺激细胞大量积累PHB。这样,为了提高最终细胞干重和产物浓度,必须采用较高的初始硫酸铵浓度,以便获得较多的细胞物质来合成PHB,但其初始浓度必须控制在生长抑制范围内:另一方面,为了使细胞生长停止后培养基中有足够的碳源来合成PHB,因而在增加氮源的同时也要增加碳源的浓度,但过高的碳源浓度不仅会对菌体的生长产生抑制作用,还有可能会使产物对基质的产率系数下降,造成发酵原料成本的上升,因而有必要确定适宜的碳源浓度。 (五)不同葡萄糖浓度对菌体生长和产物形成的影响由于细胞只有在氮源缺乏而碳源过量的条件下才能大量积累PHB,所以还必须同时确定相应的葡萄糖浓度。初始硫酸铵浓度为0.3%时,葡萄糖浓度变化对发酵的影响结果见表8-2-4 可以看出,当葡萄糖浓度为1%~6%时,细胞干重随着初糖浓度的増加而不断増加,至糖浓度为6%时,细胞干重达到最大值22.2g/L,至初糖浓度为10%时,其值下降为177g/L,比最大值时分别下降了214%;胞内PHB含量在初糖浓度为5%至7%时达到最大值,随后随初糖浓度的增加又不断下降,表明初糖浓度过高会影响菌体细胞的生长和产物PHB的合成 PHB对葡萄糖的产率系数在初糖浓度为4%时达到最大值0.34g/g,较高或较低的初糖浓度都会导致PHB对葡萄糖的产率系数下降;在初糖浓度为6%时可获得最大的PHB浓度,但PHB 对葡萄糖的产率系数下降为0.31g。从残糖浓度变化可以看出,当硫酸铵浓度为0.3%,初糖为6%以上时,发酵结束就会有较多的残糖积累。可见,在一定的硫酸铵浓度下,初糖浓度的提高可以得到较高的PHB浓度,但却会使PHB对葡萄糖的产率系数下降,因而采用分批摇瓶发酵法不可能同时获得高的PHB浓度和PHB对葡萄糖的产率系数。表8-2-4不同的糖浓度对菌体生长和PHB积累的影响初糖浓度菌体干重PHB含量PHB浓度残糖浓度PHB对葡萄糖的产率系数 /% /% 10.6 67.8 00000 0.33 16 0.33 567890 78.6 17.3 0.31 78.0 0.30 0.27 673 0.25 17.7 11.6 0.22 注发酵时间为40h,初始硫酸铵浓度0.3% (六)糖铵比对PHB发酵过程影响的分析从前面的研究结果可以发现,在PHB的发酵中,碳源和氮源是影响PHB发酵指标的两种最主要的基质,碳源浓度过高时,不仅会影响菌体的生长,还会降低PHB对葡萄糖的产率系数,导致PHB发酵过程原材料成本的增加:氮源浓度过高时,不仅也会影响菌体的生长,还会降低最终胞内PHB的含量,增加后提取过程的难度和成本。因而有必要综合考虑PHB分批发酵中碳氮源对PHB发酵指标的影响。将表8-24中的数据以葡萄糖和硫酸铵之比(简称糖铵比)分别对PHB含量和PHB对葡萄糖的产率系数作图,结果见图8-2-2 图8-2-3为不同糖铵比下PHB含量和PHB对葡萄糖的产率系数的变化关系。从糖铵比与 11

11 才能刺激细胞大量积累 PHB。这样，为了提高最终细胞干重和产物浓度，必须采用较高的初始硫酸铵浓度，以便获得较多的细胞物质来合成 PHB，但其初始浓度必须控制在生长抑制范围内；另一方面，为了使细胞生长停止后培养基中有足够的碳源来合成 PHB，因而在增加氮源的同时也要增加碳源的浓度，但过高的碳源浓度不仅会对菌体的生长产生抑制作用，还有可能会使产物对基质的产率系数下降，造成发酵原料成本的上升，因而有必要确定适宜的碳源浓度。 (五)不同葡萄糖浓度对菌体生长和产物形成的影响由于细胞只有在氮源缺乏而碳源过量的条件下才能大量积累 PHB，所以还必须同时确定相应的葡萄糖浓度。初始硫酸铵浓度为 0.3 %时，葡萄糖浓度变化对发酵的影响结果见表 8-2-4。可以看出，当葡萄糖浓度为 1 %～6 %时，细胞干重随着初糖浓度的增加而不断增加，至糖浓度为 6 %时，细胞干重达到最大值 22.2 g/L，至初糖浓度为 10 %时，其值下降为 17.7 g/L，比最大值时分别下降了 21.4 %；胞内 PHB 含量在初糖浓度为 5 %至 7 %时达到最大值，随后随初糖浓度的增加又不断下降，表明初糖浓度过高会影响菌体细胞的生长和产物 PHB 的合成； PHB 对葡萄糖的产率系数在初糖浓度为 4 %时达到最大值 0.34 g/g，较高或较低的初糖浓度都会导致 PHB 对葡萄糖的产率系数下降；在初糖浓度为 6 %时可获得最大的 PHB 浓度，但 PHB 对葡萄糖的产率系数下降为 0.31 g/L。从残糖浓度变化可以看出，当硫酸铵浓度为 0.3 %，初糖为 6 %以上时，发酵结束就会有较多的残糖积累。可见，在一定的硫酸铵浓度下，初糖浓度的提高可以得到较高的 PHB 浓度，但却会使 PHB 对葡萄糖的产率系数下降，因而采用分批摇瓶发酵法不可能同时获得高的 PHB 浓度和 PHB 对葡萄糖的产率系数。表 8-2-4 不同的糖浓度对菌体生长和 PHB 积累的影响初糖浓度 / % 菌体干重 / gL -1 PHB 含量 / % PHB 浓度 / gL -1 残糖浓度 / % PHB 对葡萄糖的产率系数/ gg -1 1 6.7 21.7 1.5 0 0.15 2 10.6 54.9 5.8 0 0.29 3 14.5 67.8 9.8 0 0.33 4 18.9 73.3 13.8 0 0.34 5 21.0 78.3 16.4 0 0.33 6 22.2 78.6 17.3 0.55 0.31 7 20.8 78.0 16.2 1.60 0.30 8 18.9 73.1 13.8 2.89 0.27 9 18.4 67.3 12.4 4.05 0.25 10 17.7 65.6 11.6 4.72 0.22 注:发酵时间为 40 h，初始硫酸铵浓度 0.3 % (六)糖铵比对 PHB 发酵过程影响的分析从前面的研究结果可以发现，在 PHB 的发酵中，碳源和氮源是影响 PHB 发酵指标的两种最主要的基质，碳源浓度过高时，不仅会影响菌体的生长，还会降低 PHB 对葡萄糖的产率系数，导致 PHB 发酵过程原材料成本的增加；氮源浓度过高时，不仅也会影响菌体的生长，还会降低最终胞内 PHB 的含量，增加后提取过程的难度和成本。因而有必要综合考虑 PHB 分批发酵中碳氮源对 PHB 发酵指标的影响。将表 8-2-4 中的数据以葡萄糖和硫酸铵之比(简称糖铵比)分别对 PHB 含量和 PHB 对葡萄糖的产率系数作图，结果见图 8-2-2。图 8-2-3 为不同糖铵比下 PHB 含量和 PHB 对葡萄糖的产率系数的变化关系。从糖铵比与

△ Gluose cor 9 Ammonium sulfate conc 詈10 图8-2-4wSH3的摇瓶发酵过程曲线之二 (八)PHB摇瓶发酵的补料研究在分析了PHB摇瓶发酵过程曲线基础上,根据PHB发酵中菌体生长和PHB合成阶段基质的消耗情况,作者进行一系列不同总糖浓度条件下,PHB摇瓶发酵定时补料试验,结果见表8-2-5。表8-2-5PHB摇瓶发酵定时补料试验补料方案细胞干重PHB浓度PHB含量PHB产率 (Ⅰ)总糖4%一次投入 18.9 73.3 0.34 总硫酸铵0.3%12h流加一次糖 18.7 13.9 74.1 0.35 (Ⅱ)总糖6%一次投入总硫酸铵0.4%12h、24h流加二次糖 27.3 21.8 79.7 0.36 (Ⅲ)总糖7.5%一次投入 21.7 76.9 0.30 总硫酸铵04%12h、24h和36h流加三次35.1 28.3 0.36 初始硫酸铵浓度均为0.3%,第Ⅱ、第Ⅲ组第12h流加0.%硫酸铵;流加组的初糖浓度均为3%。第Ⅰ组和第Ⅱ组的发酵时间为40h,第Ⅲ组的发酵时间为50h 可以看出,在较低总糖浓度的情况下,定时补料操作效果不明显,但当葡萄糖和硫酸铵总浓度较高时,采用定时补料操作方式有利于提高细胞干重和PHB浓度,与对照相比,胞内 PHB含量和PHB对葡萄糖的产率系数也有明显的提高,这可能是由于较高的硫酸铵或葡萄糖浓度对菌体的生长或PHB的合成过程存在一定的抑制作用,而定时补料操作能在一定程度上改善这种抑制作用,因而能取得较好的发酵结果。由此可见,在PHB的发酵过程中,采用定时补料操作可明显提高PHB浓度、胞内PHB含量和PHB对葡萄糖的产率系数。另外,PHB 含量和PHB对葡萄糖的产率系数的提高,可分别降低PHB的提取成本和发酵原料成本,有利于降低总的PHB发酵生产成本 (九)菌体细胞积累PHB前后的透射电镜照片为了考察PHB积累前后菌体细胞的结构形态,对发酵前、后期的细胞分别拍摄了透射电镜照片,见图8-2-5。从图8-2-5A中可以看出,在氮源丰富的发酵前期,细胞基本上不积累 PHB:而在发酵后期,培养基中氮源耗尽,细胞大量积累PHB,从图8-2-6B中可见,几乎所有的细胞都充满了PHB颗粒

13 Residual biomass Glucose conc. Ammonium sulfate conc. 图 8-2-4 WSH3 的摇瓶发酵过程曲线之二 (八)PHB 摇瓶发酵的补料研究在分析了 PHB 摇瓶发酵过程曲线基础上，根据 PHB 发酵中菌体生长和 PHB 合成阶段基质的消耗情况，作者进行一系列不同总糖浓度条件下，PHB 摇瓶发酵定时补料试验，结果见表 8-2-5。表 8-2-5 PHB 摇瓶发酵定时补料试验补料方案细胞干重 / gL -1 PHB 浓度 / gL -1 PHB 含量 / % PHB 产率 / gg -1 (Ⅰ) 总糖 4 % 一次投入 18.9 13.8 73.3 0.34 总硫酸铵 0.3 % 12 h 流加一次糖 18.7 13.9 74.1 0.35 (Ⅱ) 总糖 6 % 一次投入 22.2 17.3 78.6 0.31 总硫酸铵 0.4 % 12 h、24 h 流加二次糖 27.3 21.8 79.7 0.36 (Ⅲ) 总糖 7.5 % 一次投入 21.7 16.7 76.9 0.30 总硫酸铵 0.4 % 12 h、24 h 和 36 h 流加三次糖 35.1 28.3 80.5 0.36 注: 初始硫酸铵浓度均为 0.3 %, 第Ⅱ、第Ⅲ组第 12 h 流加 0.1 %硫酸铵; 流加组的初糖浓度均为 3 %。第Ⅰ组和第Ⅱ组的发酵时间为 40 h, 第Ⅲ组的发酵时间为 50 h。可以看出，在较低总糖浓度的情况下，定时补料操作效果不明显，但当葡萄糖和硫酸铵总浓度较高时，采用定时补料操作方式有利于提高细胞干重和 PHB 浓度，与对照相比，胞内 PHB 含量和 PHB 对葡萄糖的产率系数也有明显的提高，这可能是由于较高的硫酸铵或葡萄糖浓度对菌体的生长或 PHB 的合成过程存在一定的抑制作用，而定时补料操作能在一定程度上改善这种抑制作用，因而能取得较好的发酵结果。由此可见，在 PHB 的发酵过程中，采用定时补料操作可明显提高 PHB 浓度、胞内 PHB 含量和 PHB 对葡萄糖的产率系数。另外，PHB 含量和 PHB 对葡萄糖的产率系数的提高，可分别降低 PHB 的提取成本和发酵原料成本，有利于降低总的 PHB 发酵生产成本。 (九)菌体细胞积累 PHB 前后的透射电镜照片为了考察 PHB 积累前后菌体细胞的结构形态，对发酵前、后期的细胞分别拍摄了透射电镜照片，见图 8-2-5。从图 8-2-5A 中可以看出，在氮源丰富的发酵前期，细胞基本上不积累 PHB；而在发酵后期，培养基中氮源耗尽，细胞大量积累 PHB，从图 8-2-6B 中可见，几乎所有的细胞都充满了 PHB 颗粒

A:发酵前期 B:发酵后期图8-2-5菌体细胞积累PHB前后的透射电镜照片、PHB发酵过程中理论产率的计算阻碍PHB大规模工业化生产的一个主要障碍就是其相对高的生产成本。PHB是仅有C、 H和O元素组成的多聚物,在合成PHB所需的基质中,碳源的消耗量最大,所占发酵原料成本的比例也最大,因而,产物PHB对碳源的产率(YPC),是影响PHB工业化规模生产的重要因素 (一)PHB发酵过程的理论产率和总产率从简单的数学角度考虑很容易推断,在假定没有非PHB部分的残留菌体合成时,产物PHB 对碳源的产率Ypv,可达到最大值,该最大值被命名为PHB对碳源的理论产率Yp;当考虑到在平衡生长阶段形成菌体所消耗的碳源时,该实际产率ymm称为总产率。通常有两种不同的方法来计算理论产率的值,即化学计量法和生化计量法。在后一种方法中,必须考虑合成PHB过程的代谢途径和辅酶的再循环过程在非生长条件下,PHB形成的产率集中于辅酶的质量平衡,如NADP、NAD、ATP和辅酶A,这些辅酶包含在PHB生物合成的代谢途径中。在大多数细菌中,PHB是从乙酰辅酶 A经三个连续的反应而形成的,这三个反应分别被3-酮基硫解酶、依赖于 NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶所催化。必须注意到乙酰乙酰辅酶A还原酶是与 NADPH相联的,即该酶仅催化下列反应乙酰辅酶A+ NADPH+H+ D(-)-3-羟基丁基辅醇A+NADP+(8-2-1) 在一些微生物如 Zoogloea ramigero和R. eutrophus中已检测到另一个与NADH相关联的还原酶,但其产物为L(+)-3-羟基丁基-辅酶A,该产物不能作为PHB合成酶的基质。在一个由纯化的3-酮基硫解酶、依赖于 NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶所组成的系统中,发现仅有与 NADPH相关联的还原酶参与从乙酰辅酶A至PHB的合成过程。因而从该反应中所产生的NADP须从另一个生化反应中得到再生,以便使PHB的生物合成能继续进行该事实迫使我们去寻找一个PHB合成途径以外的 NADPH再生反应。通过分析几种PHB产生菌的生物合成系统,可以认为有三个酶能作为参与 NADPH再生反应的成员,它们分别是:(1) 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,(2)6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,(3)三羧酸循环中的异柠檬酸脱氢酶。通

14 A：发酵前期 B：发酵后期图 8-2-5 菌体细胞积累 PHB 前后的透射电镜照片三、PHB 发酵过程中理论产率的计算阻碍 PHB 大规模工业化生产的一个主要障碍就是其相对高的生产成本。PHB 是仅有 C、 H 和 O 元素组成的多聚物，在合成 PHB 所需的基质中，碳源的消耗量最大，所占发酵原料成本的比例也最大，因而，产物 PHB 对碳源的产率(YP/C)，是影响 PHB 工业化规模生产的重要因素。 (一)PHB 发酵过程的理论产率和总产率从简单的数学角度考虑很容易推断，在假定没有非 PHB 部分的残留菌体合成时，产物 PHB 对碳源的产率 YP/C，可达到最大值，该最大值被命名为 PHB 对碳源的理论产率 ( ) / theor YP C ；当考虑到在平衡生长阶段形成菌体所消耗的碳源时，该实际产率 ( ) / overall YP C 称为总产率。通常有两种不同的方法来计算理论产率的值，即化学计量法和生化计量法。在后一种方法中，必须考虑合成 PHB 过程的代谢途径和辅酶的再循环过程。在非生长条件下，PHB 形成的产率集中于辅酶的质量平衡，如 NADP+、NAD+、ATP 和辅酶 A，这些辅酶包含在 PHB 生物合成的代谢途径中。在大多数细菌中，PHB 是从乙酰辅酶 A 经三个连续的反应而形成的，这三个反应分别被 3-酮基硫解酶、依赖于 NADPH 的乙酰乙酰辅酶 A 还原酶和 PHB 合成酶所催化。必须注意到乙酰乙酰辅酶 A 还原酶是与 NADPH 相联的，即该酶仅催化下列反应：乙酰辅酶 A + NADPH + H+ D(-)-3-羟基丁基-辅酶 A+NADP+ (8-2-1) 在一些微生物如 Zoogloea ramigera 和 R. eutrophus 中已检测到另一个与 NADH 相关联的还原酶，但其产物为 L(+)-3-羟基丁基-辅酶 A，该产物不能作为 PHB 合成酶的基质。在一个由纯化的 3-酮基硫解酶、依赖于 NADPH 的乙酰乙酰辅酶 A 还原酶和 PHB 合成酶所组成的系统中，发现仅有与 NADPH 相关联的还原酶参与从乙酰辅酶 A 至 PHB 的合成过程。因而从该反应中所产生的NADP+须从另一个生化反应中得到再生，以便使PHB的生物合成能继续进行，该事实迫使我们去寻找一个 PHB 合成途径以外的 NADPH 再生反应。通过分析几种 PHB 产生菌的生物合成系统，可以认为有三个酶能作为参与 NADPH 再生反应的成员，它们分别是：(1) 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，(2) 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，(3) 三羧酸循环中的异柠檬酸脱氢酶。通

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