Poly-A tail mRNA 3 AAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 5 Add primer (poly-d AAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Poly-dT primer Add reverse transcriptase AAAAA TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 5 Double-stranded duplex 3 AAAAA TTTTTTTTTTTTT TTTT +++⊥ I⊥ IIIIIIIIIII Digest RNA Single-stranded CDNA TITTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Add DNA polymerase I Klenow TTTT AAAAA Add S1 nuclease to cleave hairpin 5′TTTT TTTTTT Double-stranded CDNA ⊥⊥⊥⊥
Klenow
、S1核酸酶: 来自于稻谷曲霉,该酶只水解单链DNA,用 于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的 处理。 七、碱性磷酸酶: 来自于大肠杆菌( bacterial alkaline phosphatase BAP)或小牛肠( calf intestinal alkaline phosphatase CIP),该酶用于脱去DNA(RNA)53末端的磷酸 根,使53-P成为5-OH,该过程称核酸分子的脱磷 酸作用。当需要53端同位素标记或为了避免DNA片 段自身连接(或环化)时可进行脱磷反应
六、S1核酸酶： 来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用 于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的 处理。 七、碱性磷酸酶： 来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸 根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷 酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片 段自身连接（或环化）时可进行脱磷反应
第二节目的基因的制备 化学合成法: 1979年 Khorana首先成功地合成了tRNA基因 在体外,可以合成一系列长约几百bp的寡聚 核苷酸链,然后按照基因的顺序将这些短的核苷酸 链连接起来 化学合成的不足之处在于:(1)要知基因 的核苷酸顺序;(2)基因不能太大,这一方面是 测定核苷酸(或氨基酸)顺序比较困难,另一方面 是因为每次仅能合成几百bp的短片段,短片段越 多,要连接成正确的基因顺序就越困难,得率越低 价格
第二节 目的基因的制备 一、化学合成法： 1979年Khorana首先成功地合成了tRNA基因。 在体外，可以合成一系列长约几百ｂｐ的寡聚 核苷酸链，然后按照基因的顺序将这些短的核苷酸 链连接起来。 化学合成的不足之处在于：（１）要已知基因 的核苷酸顺序；（２）基因不能太大，这一方面是 测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面 是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段，短片段越 多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低； （３）价格昂贵
化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困 难的基因。同时,所合成的基因不含内含子。在原 核生物中由于不能进行内含子剪接,所以一旦将含 有内含子的基因引入原核生物中表达,其产物往往 是没有活性的。 由于化学合成法有上述一些优缺点,所以这种 方法较多地用于合成一些比较小的基因,如某些激 素基因。并也取得一些成功的例子,例如胰岛素基 因,生长激素释放抑制激素基因等。 由于技术的进步,目前已极少利用化学合成 法制备目的基因,而是利用DNA的化学合成法合 成一些短的DNA片段作为探针(pobe)或PCR的 引物
化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困 难的基因。同时，所合成的基因不含内含子。在原 核生物中由于不能进行内含子剪接，所以一旦将含 有内含子的基因引入原核生物中表达，其产物往往 是没有活性的。 由于化学合成法有上述一些优缺点，所以这种 方法较多地用于合成一些比较小的基因，如某些激 素基因。并也取得一些成功的例子，例如胰岛素基 因，生长激素释放抑制激素基因等。 由于技术的进步，目前已极少利用化学合成 法制备目的基因，而是利用DNA的化学合成法合 成一些短的DNA片段作为探针（probe）或PCR的 引物
表4-2已有报道过的化学合成的基因 基因 大小(bp)合成年代表达情况 tRNA 126 1979 a-干扰素 542 1981 E 肠促胰液肽 81 1982 E 尿抑胃激素 162 1982 E 干扰素 453 1984 E Eg linC 232 1984 E 视紫红质 10571985E 前脑菲肽 77 1985 E ATP酶 170001985。? 结缔组织活性酶Ⅱ 280 1985 溶菌酶 385 1985 E, S 组织血纤维蛋白溶酶原激活因子 1610 985 C— Ha-Yas 576 1986 E RNA酶T 324 1986 E 细胞色素b 330 986 E 牛肠道结合钙蛋白 298 1986 E 水蛭素 226 RNA酶A 375 1986(p E 1987 E:在E.co中表达;S:在酿酒酵母中表达;“以融合蛋白形式表达;?:表达实验的结果未见报道