Eukaryotic DNA Plasmid dna C 3′ add poly-dT tails Terminal deoxynucleotidyl transferase add poly-da tails A-A-A-G-G-GTTT3 G-G-G-T-T-T 5 5TTTC-CCAA-A-G-G-GTTT Annealing of fragments Ligation with DNA ligase TTTC-C-CA-A-A-G-G-G 3′ G-G-G-T-T-T C-C-C 5
平末端的另一种处理方式是利用衔接物( linker 进行处理,人工加上粘性末端。衔接物是一种人工 合成的小分子DNA,约10~20个核苷酸,其结构特 征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文 结构。如: Bamh I或Sau3A HpaⅡ pa II H CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端DNA分子连接,再用限 制性核酸内切酶酶切,便可产生粘性末端 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点
平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker） 进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工 合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特 征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文 结构。如： CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限 制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。 Hpa II Hpa II BamH I 或Sau3A
三、DNA连接酶( DNAligase) 该酶常从T4噬菌体的受感细胞中提取,是由 T4噬菌体基因组所编码的,所以基因工程中常用 的连接酶是T4连接酶。它可催化DNA中磷酸二 脂键的形成,从而使两个片段以共价键的形式结合 起来。 DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退 火后能很好地连接,对平末端的DNA分子也可以 进行连接,但连接效率较低,必须加大酶的用量
三、ＤＮＡ连接酶（DNAligase） 该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由 Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用 的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二 脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合 起来。 DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退 火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以 进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量
⊥1LC-+T千-AAG11 TTTG-A-A-TTTT千 TTT-A-A-TT千TT C-T-T-A-A-G Cleavage with EcoRI Cleavage with ecoRI G A-A-T-T-C ⊥C-T-T-A-A Fragments with complementary tails Gap binant TTTGA-A-T-T-CTIT DNA molecules to form b complementary base pairing LLC-T-T-A-Ag 1 The two strands are not covalently Ga bonded as indicated by circled gaps DNA ligase TTTG-A-A-T-T-C T DNA ligase seals the gaps covalently bonding the ⊥⊥C-T-T-A-AG two strands
四、反转录酶( reverse transcriptase) 这类酶来自于反转录病毒,它可以RNA为模板,催 化合成DNA。目前常用的有禽源(AMV)及鼠源(M MLV)反转录酶两种。 五、 DNA pol I及 Klenow片段 该酶常用于制备放射性比度比活体标记高得多的DN Δ探针,探针的制备方法是采用所谓的缺口平移(nick translation)法制备的。 该酶还用于裂口(gap)修补、反转录第二条链的合成 ( Klenow)、隐蔽末端的填平反应( Klenow)等。 Klenow片段: DNA pol I用枯草杆菌蛋白酶水解成两个片 段,小片段(36KD)具有53核酸外切酶活性,大片段 (76KD)称为 Klenow片段,具有DNA链聚合及35核酸 外切酶的活性
四、反转录酶（reverse transcriptase） 这类酶来自于反转录病毒，它可以ＲＮＡ为模板，催 化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（MMLV）反转录酶两种。 五、DNA pol I及Klenow片段 该酶常用于制备放射性比度比活体标记高得多的ＤＮ Ａ探针，探针的制备方法是采用所谓的缺口平移（nick translation）法制备的。 该酶还用于裂口（gap）修补、反转录第二条链的合成 （ Klenow ）、隐蔽末端的填平反应（ Klenow ）等。 Klenow片段：DNA pol I 用枯草杆菌蛋白酶水解成两个片 段，小片段（36KD）具有5’ 3’ 核酸外切酶活性，大片段 （76KD）称为Klenow片段，具有DNA链聚合及3’ 5’核酸 外切酶的活性