实验十七、实时荧光PCR检 测沙门氏菌(salmonella.spp)
实验十七、实时荧光PCR检 测沙门氏菌(salmonella .spp)
一、实验目的： 学习采用实时荧光PCR仪检测食品、化妆品 等中的沙门氏菌(salmonella.spp)的特异检测。 ■二、实验原理： ■试剂盒采用PCR方法结合荧光探针的体外扩 增和检测技术，适用于食品、卫生防疫、化妆 品等沙门氏菌(salmonella.spp)的特异检测
◼ 一、实验目的： ◼ 学习采用实时荧光PCR仪检测食品、化妆品 等中的沙门氏菌(salmonella .spp)的特异检测。 ◼ 二、实验原理： ◼ 试剂盒采用PCR 方法结合荧光探针的体外扩 增和检测技术，适用于食品、卫生防疫、化妆 品等沙门氏菌(salmonella .spp)的特异检测
三、仪器与试剂 1、试剂盒组成 ■DNA提取液 PCR反应液 Tag酶 ■UNG酶阳性对照阴性对照 ■2、仪器 Roche lightcycler,.ABl系列MJ opticon2,Bio Rad/博日Iine-gene荧光PCR检测仪
三、仪器与试剂 ◼ 1、试剂盒组成 ◼ DNA提取液 ◼ PCR反应液 ◼ Taq 酶 ◼ UNG酶阳性对照阴性对照 ◼ 2、仪器 ◼ Roche lightcycler, ABI系列/MJ opticon2，BioRad/博日line-gene荧光PCR检测仪
四、实验步骤 样品的收集及处理以及增菌培养 严格按照无菌操作规程称取25g样品按国标法进行增菌 培养。增菌样品可暂存4℃冰箱，24小时内检验。 ■使用方法（使用前请仔细阅读本操作流程） 1、增菌液处理（样本处理区） 增菌液的处理可以采取以下方法： 取待测样本增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中， 8,000rpm离心5min,尽量吸弃上清；加入50 ul DNA提 取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀 后沸水浴5min,13,000rpm离心5min,取上清保存于- 20℃备用以待检测
四、实验步骤 ◼ 样品的收集及处理以及增菌培养 ◼ 严格按照无菌操作规程称取25g样品按国标法进行增菌 培养。增菌样品可暂存4℃冰箱，24小时内检验。 ◼ 使用方法（使用前请仔细阅读本操作流程） ◼ 1、增菌液处理（样本处理区） ◼ 增菌液的处理可以采取以下方法： ◼ 取待测样本增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中， 8,000rpm离心5min，尽量吸弃上清；加入50ul DNA提 取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀 后沸水浴5min，13,000rpm离心5min，取上清保存于- 20℃备用以待检测
2、扩增试剂准备(PCR前准备区) 从试剂盒中取出PCR反应液，室温融化并振荡混匀，取出Tag 酶及UNG酶，每一次使用时2000rpm离心10sec,以收集粘在 管壁上的酶贮液。 设所需要的PCR反应管管数为(n=1管阴性对照+1管阳性 对照+样本数)，每个测试反应体系配制如下表： 试剂 PCR反应液 Taq酶 UNG酶 用量(L) 22.5 0.5 0.06 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，颠倒混匀， 2000rpm离心10sec,向设定的n个PCR反应管中分别加入 23u,一转移至样本处理区
◼ 2、扩增试剂准备（PCR 前准备区） ◼ 从试剂盒中取出PCR 反应液，室温融化并振荡混匀，取出Taq 酶及UNG酶，每一次使用时2000rpm离心10sec，以收集粘在 管壁上的酶贮液。 ◼ 设所需要的PCR反应管管数为n（n = 1管阴性对照+ 1管阳性 对照+样本数），每个测试反应体系配制如下表： ◼ 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，颠倒混匀， 2000rpm离心10sec，向设定的n个PCR 反应管中分别加入 23ul，转移至样本处理区。 试剂 PCR反应液 Taq酶 UNG酶 用量(μL) 22.5 0.5 0.06