精确称取粉制酶制剂 1.0g 用 PH 11 的硼酸钠—氢氧化钠缓冲液溶解并定容到 200ml,于 40℃浸取 30min，滤纸过滤，取 2ml 滤液用 PH11 的硼酸钠-氢氧化纳缓冲液定容到 50mL。 (2)比色测定 取 10mL 离心管 4 支分别加入稀释筋液 1.0mL。 平行试验 3 支 空白试验 1 支 ①于 40℃水浴预热 2—3min。 ①于 40℃水浴预热 2—3min。 ②加 1.0mL 40℃预热的 2％酪蛋 ②加 2.0mL 0.4mol/L 三氯醋酸 40℃保 白，于 40℃反应 10min。 温 10min。 ③加 2.OmL 0.4mol/L 三氯醋酸反 ③加 l.0mL 2％的酪蛋白，反应 15min 应 15min 过滤。 过滤。 ④取过滤液 1.0mL 放入盛有 5mL Na2C03 溶液的试管中。 ⑤加 1.0mL l：2 稀释的福林—酚试剂(此试剂应最后加入)于 40℃水浴发色 20 min。 ⑥7220 型分光光度计在 680nm 比色，比色皿厚 1cm。 (3)比色常数(K)的求法 将 DL-酪氨酸于 105℃烘 2h，精确称取 0.1000g，加少量 0.2mol/L 盐酸加热溶解，用 蒸馏水定容到 1000mL(每毫升含 DL-酪氨酸 100.0 µg)，取 5 支试管，按下表加样。 编号 1 2 3 4 5 酪氨酸/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 H2O/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Na2CO3/ml 5 5 5 5 5 福林-酚/ml 1 1 1 1 1 OD680 摇匀于 40℃发色 20min，以 0 号管为空白，在 680nm 进行比色。 以吸光度 OD 为纵坐标，以 DL-酪氨酸含量(µg)为横坐标作一直线，可求出比色常数 K —单位吸光度值相当 DL-酪氨酸的 µg 数，见示意图 1。 图 1 DL-酪氨酸标准曲线示意图 (4)计算
精确称取粉制酶制剂 1.0g 用 PH 11 的硼酸钠—氢氧化钠缓冲液溶解并定容到 200ml,于 40℃浸取 30min，滤纸过滤，取 2ml 滤液用 PH11 的硼酸钠-氢氧化纳缓冲液定容到 50mL。 (2)比色测定 取 10mL 离心管 4 支分别加入稀释筋液 1.0mL。 平行试验 3 支 空白试验 1 支 ①于 40℃水浴预热 2—3min。 ①于 40℃水浴预热 2—3min。 ②加 1.0mL 40℃预热的 2％酪蛋 ②加 2.0mL 0.4mol/L 三氯醋酸 40℃保 白，于 40℃反应 10min。 温 10min。 ③加 2.OmL 0.4mol/L 三氯醋酸反 ③加 l.0mL 2％的酪蛋白，反应 15min 应 15min 过滤。 过滤。 ④取过滤液 1.0mL 放入盛有 5mL Na2C03 溶液的试管中。 ⑤加 1.0mL l：2 稀释的福林—酚试剂(此试剂应最后加入)于 40℃水浴发色 20 min。 ⑥7220 型分光光度计在 680nm 比色，比色皿厚 1cm。 (3)比色常数(K)的求法 将 DL-酪氨酸于 105℃烘 2h，精确称取 0.1000g，加少量 0.2mol/L 盐酸加热溶解，用 蒸馏水定容到 1000mL(每毫升含 DL-酪氨酸 100.0 µg)，取 5 支试管，按下表加样。 编号 1 2 3 4 5 酪氨酸/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 H2O/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Na2CO3/ml 5 5 5 5 5 福林-酚/ml 1 1 1 1 1 OD680 摇匀于 40℃发色 20min，以 0 号管为空白，在 680nm 进行比色。 以吸光度 OD 为纵坐标，以 DL-酪氨酸含量(µg)为横坐标作一直线，可求出比色常数 K —单位吸光度值相当 DL-酪氨酸的 µg 数，见示意图 1。 图 1 DL-酪氨酸标准曲线示意图 (4)计算
活力单位规定：在 pH11，40℃，1min 内产生 1g 酪氨酸的酶量(g)为一个活力单位。 总活力(U/g)＝K× 10 4 ×OD×稀释倍数 式中 K—为比色常数，DL—酪氨酸 µg／吸光度； OD——吸光度； 稀释倍数——200 50/2； 4——酶活测定液的稀释倍数； 10——酶促反应时间，min。 六、思考题 1. 0.4mol/L 碳酸钠、0.4mol/L 三氯醋酸溶液的作用是什么? 2. 为什么要把反应条件控制在 pH 值为 11、温度为 40℃? 3. 稀释的酶溶液是否可以长期使用?为什么? 实验五：植物组织中 DNA 和 RNA 的提取和鉴定 一、实验目的 ①学习和掌握从植物组织中分离核酸的原理和操作方法。 ②学习和掌握测定核酸含量的定糖法（苔黑酚法和二苯胺法）的原理及操作方法。 二、实验原理 核酸是生物体内的主要化学成分，核酸在生物体内主要以核蛋白的形式存在。核酸分
活力单位规定：在 pH11，40℃，1min 内产生 1g 酪氨酸的酶量(g)为一个活力单位。 总活力(U/g)＝K× 10 4 ×OD×稀释倍数 式中 K—为比色常数，DL—酪氨酸 µg／吸光度； OD——吸光度； 稀释倍数——200 50/2； 4——酶活测定液的稀释倍数； 10——酶促反应时间，min。 六、思考题 1. 0.4mol/L 碳酸钠、0.4mol/L 三氯醋酸溶液的作用是什么? 2. 为什么要把反应条件控制在 pH 值为 11、温度为 40℃? 3. 稀释的酶溶液是否可以长期使用?为什么? 实验五：植物组织中 DNA 和 RNA 的提取和鉴定 一、实验目的 ①学习和掌握从植物组织中分离核酸的原理和操作方法。 ②学习和掌握测定核酸含量的定糖法（苔黑酚法和二苯胺法）的原理及操作方法。 二、实验原理 核酸是生物体内的主要化学成分，核酸在生物体内主要以核蛋白的形式存在。核酸分
为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。DNA 主要存在与在细胞核中，RNA 主要 存在于细胞质中。 用冰冷的稀三氯乙酸或高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物 质。再由有机溶剂如乙醇、乙醚等抽提，去除脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液（10% 氯化钠溶液）和 0.5mol/L 高氯酸（70℃）分别提取 DNA 和 RNA。 由于核酸和脱氧核糖核酸有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围 内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比。因此可用定糖法来定性定量测定核酸。 ① 核糖的测定：测定核糖的常用方法是苔黑酚法（3，5—二羟基甲苯，即 Orcinol 反应）。 当含有核糖的 RNA 与浓盐酸及 3，5—二羟基甲苯在沸水水浴中加热 10～20min 后，有绿 色物产生，这是因为 RNA 脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与 3，5—二羟基甲 苯作用生成绿色物质。 RNA+浓硫酸+ OH CH3 OH 3 100 FeCl C o 绿色化合物 注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。 ② 脱氧核糖的测定：测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的 DNA 在酸 性条件下和二苯胺在沸水浴中共热后，产生蓝色。这是因为 DNA 嘌呤核苷酸上的脱氧核 糖遇酸生成ω-羟基-6-酮基戊醛，再与二苯胺作用产生蓝色物质。 DNA+少量浓硫酸或冰乙酸+ NH ⎯⎯⎯C→ o 100 蓝色物质 注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。 此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。 上述两种定糖的方法准确性较差，但快速简便，能鉴别 DNA 和 RNA，是鉴定核酸、核 苷酸的常用方法。 三、实验器材 ① 恒温水浴 ② 电炉 ③ 布氏漏斗装置 ④ 移液管 ⑤ 烧杯 ⑥ 量筒 ⑦ 剪刀 ⑧ 研体 四、材料和试剂 ① 新鲜菜花 ② 95%乙醇 ③ 丙酮 ④ 5%高氯酸溶液 ⑤ 0.5mol/L 三氯酸溶液 ⑥ 10%氯化钠溶液
为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。DNA 主要存在与在细胞核中，RNA 主要 存在于细胞质中。 用冰冷的稀三氯乙酸或高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物 质。再由有机溶剂如乙醇、乙醚等抽提，去除脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液（10% 氯化钠溶液）和 0.5mol/L 高氯酸（70℃）分别提取 DNA 和 RNA。 由于核酸和脱氧核糖核酸有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围 内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比。因此可用定糖法来定性定量测定核酸。 ① 核糖的测定：测定核糖的常用方法是苔黑酚法（3，5—二羟基甲苯，即 Orcinol 反应）。 当含有核糖的 RNA 与浓盐酸及 3，5—二羟基甲苯在沸水水浴中加热 10～20min 后，有绿 色物产生，这是因为 RNA 脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与 3，5—二羟基甲 苯作用生成绿色物质。 RNA+浓硫酸+ OH CH3 OH 3 100 FeCl C o 绿色化合物 注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。 ② 脱氧核糖的测定：测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的 DNA 在酸 性条件下和二苯胺在沸水浴中共热后，产生蓝色。这是因为 DNA 嘌呤核苷酸上的脱氧核 糖遇酸生成ω-羟基-6-酮基戊醛，再与二苯胺作用产生蓝色物质。 DNA+少量浓硫酸或冰乙酸+ NH ⎯⎯⎯C→ o 100 蓝色物质 注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。 此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。 上述两种定糖的方法准确性较差，但快速简便，能鉴别 DNA 和 RNA，是鉴定核酸、核 苷酸的常用方法。 三、实验器材 ① 恒温水浴 ② 电炉 ③ 布氏漏斗装置 ④ 移液管 ⑤ 烧杯 ⑥ 量筒 ⑦ 剪刀 ⑧ 研体 四、材料和试剂 ① 新鲜菜花 ② 95%乙醇 ③ 丙酮 ④ 5%高氯酸溶液 ⑤ 0.5mol/L 三氯酸溶液 ⑥ 10%氯化钠溶液
⑦ 标准 RNA 溶液（5mg/100mL） ⑧ 标准 DNA（15mg/100ml） ⑨ 粗氯化钠 ⑩ 海沙 ⑪ 二苯胺试剂：将 1g 二苯胺溶于 100ml 冰醋酸中，再加入 2.75mL 浓硫酸（置冰箱中可 保存 6 个月。使用后，在室温下摇匀）。 ⑫ 三氯化铁浓盐酸溶液：将 2ml10%三氯化铁溶液（用 FeCl3·6H20 配制加入到）400mL 浓盐酸中。 五、操作方法 1. 核酸的分离 ①取菜花的花冠 20g，剪碎后置于研钵中。加入 20mL 95％乙醇和少量诲砂，研磨 成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。 ②向滤渣中加入 20mL 丙酮，搅拌均匀,抽滤，弃去滤液。 ③再向滤渣中加人 20mL 丙酮，搅拌 5min 后抽滤(用力压滤渣，尽量除去丙酮)。 ④在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的 20mL 5％高氯酸溶液中搅拌抽滤弃去滤液。 ⑤特滤渣悬浮于 20mL 95％乙醇中，抽滤，弃去滤液。 ⑧滤渣中加入 20mL 丙酮，搅拌 5min。抽滤至干．用力压滤渣尽量除去丙酮。 ⑦将干燥的滤渣重新悬浮在 40ml10％氯化钠溶液中，在沸水浴中加热 15mln，放置、 冷却，抽滤至干，留滤液，并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并，为提取物一。 ⑧将滤渣重新悬浮在 20mL 0.5mol 儿高氯酸溶液中。加热到 70℃。保温 20 min (恒温水浴)后抽滤。留滤液为提取物二。 2．DNA 和 RNA 的定性鉴定 ①二苯胺反应：按表 1 加入各种试剂，反应后观察现象井记录结果。 表 1 二苯胺反应加入试剂 管号 1 2 3 4 5 蒸馏水/ml 1 - - - - DNA 溶液/ml - 1 - - - RNA 溶液/ml - - 1 - - 提取物一/ml - - - 1 - 提取物二/ml - - - - 1 二苯胺试剂/ml 2 2 2 2 2 放沸水浴中 10min 后的现象 ②苔黑酚反应：按表 2 加入各种试剂，反应后观察现象井记录结果。 表 2 苔黑酚反应加入试剂 管号 1 2 3 4 5 蒸馏水/ml 1 - - - - DNA 溶液/ml - 1 - - -
⑦ 标准 RNA 溶液（5mg/100mL） ⑧ 标准 DNA（15mg/100ml） ⑨ 粗氯化钠 ⑩ 海沙 ⑪ 二苯胺试剂：将 1g 二苯胺溶于 100ml 冰醋酸中，再加入 2.75mL 浓硫酸（置冰箱中可 保存 6 个月。使用后，在室温下摇匀）。 ⑫ 三氯化铁浓盐酸溶液：将 2ml10%三氯化铁溶液（用 FeCl3·6H20 配制加入到）400mL 浓盐酸中。 五、操作方法 1. 核酸的分离 ①取菜花的花冠 20g，剪碎后置于研钵中。加入 20mL 95％乙醇和少量诲砂，研磨 成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。 ②向滤渣中加入 20mL 丙酮，搅拌均匀,抽滤，弃去滤液。 ③再向滤渣中加人 20mL 丙酮，搅拌 5min 后抽滤(用力压滤渣，尽量除去丙酮)。 ④在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的 20mL 5％高氯酸溶液中搅拌抽滤弃去滤液。 ⑤特滤渣悬浮于 20mL 95％乙醇中，抽滤，弃去滤液。 ⑧滤渣中加入 20mL 丙酮，搅拌 5min。抽滤至干．用力压滤渣尽量除去丙酮。 ⑦将干燥的滤渣重新悬浮在 40ml10％氯化钠溶液中，在沸水浴中加热 15mln，放置、 冷却，抽滤至干，留滤液，并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并，为提取物一。 ⑧将滤渣重新悬浮在 20mL 0.5mol 儿高氯酸溶液中。加热到 70℃。保温 20 min (恒温水浴)后抽滤。留滤液为提取物二。 2．DNA 和 RNA 的定性鉴定 ①二苯胺反应：按表 1 加入各种试剂，反应后观察现象井记录结果。 表 1 二苯胺反应加入试剂 管号 1 2 3 4 5 蒸馏水/ml 1 - - - - DNA 溶液/ml - 1 - - - RNA 溶液/ml - - 1 - - 提取物一/ml - - - 1 - 提取物二/ml - - - - 1 二苯胺试剂/ml 2 2 2 2 2 放沸水浴中 10min 后的现象 ②苔黑酚反应：按表 2 加入各种试剂，反应后观察现象井记录结果。 表 2 苔黑酚反应加入试剂 管号 1 2 3 4 5 蒸馏水/ml 1 - - - - DNA 溶液/ml - 1 - - -