生物化学实验技术操作指导 天津科技大学 生物化学课程组 2006.12 目录 生物化学实验须知 2 实验室一些常用知识介绍 3 实验一：离子交换法分离氨基酸 7 实验二：垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 9 实验三：马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验13
生物化学实验技术操作指导 天津科技大学 生物化学课程组 2006.12 目录 生物化学实验须知 2 实验室一些常用知识介绍 3 实验一：离子交换法分离氨基酸 7 实验二：垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 9 实验三：马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验13
实验四：碱性蛋白酶活力的测定 16 实验五: 植物组织中 DNA 和 RNA 的提取和鉴定 19 实验六：糖酵解中间产物的鉴定22 实验七：综合设计实验—蛋白质的制备及其含量测定24 实验八：还原糖和总糖的测定（3，5-二硝基水杨酸法） 35 实验九：发酵过程中无机磷的利用37 实验十：氨基酸的分离鉴定—纸层析法39 实验十一：细菌血栓溶解酶活性测定41 实验十二：可溶性糖的硅胶 G 薄层层析43 实验十三：植物材料中总黄酮的提纯与鉴定44 实 验 十 四 ： IEF/SDS-PAGE 双 向 电 泳 分 离 鉴 定 蛋 白 质 45 附 录 49 一、实验室主要仪器使用操作规程与注意事项49 二、常用缓冲溶液的配制55 三、硫酸铵饱和度的常用表60 生物化学实验须知 1．实验室规则 (1) 实验课必须提前 5 分钟到实验室,不迟到,不早退，应自觉遵守课堂纪律。 (2) 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约, 应特别注意保持药品和试剂的纯 净, 严防混杂污染。 (3) 实验台、试剂药品架必须保持整洁, 仪器药品摆放井然有序。实验完毕,需将药品、 试剂排列整齐, 仪器洗净倒置放好, 实验台面抹拭干净, 经教师验收仪器后, 方可离开实验 室。 (4) 使用和洗涤仪器时, 应小心谨慎, 防止损坏仪器。使用精密仪器时, 应严格遵守操作 规程, 发现故障应立即报告教师, 不要自己动手检修。 (5) 在实验过程中要听从教师的指导, 严肃认真地按操作规程进行实验, 并简要、准确 地将实验结果和数据记录在实验记录本上。课后写出实验报告, 由课代表收齐交给教师。 (6)仪器损坏时, 应如实向教师报告, 真填写损坏仪器登记表, 然后补偿一定金额。 (7)每次实验课安排同学轮流值日, 值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。 2．实验记录 实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写
实验四：碱性蛋白酶活力的测定 16 实验五: 植物组织中 DNA 和 RNA 的提取和鉴定 19 实验六：糖酵解中间产物的鉴定22 实验七：综合设计实验—蛋白质的制备及其含量测定24 实验八：还原糖和总糖的测定（3，5-二硝基水杨酸法） 35 实验九：发酵过程中无机磷的利用37 实验十：氨基酸的分离鉴定—纸层析法39 实验十一：细菌血栓溶解酶活性测定41 实验十二：可溶性糖的硅胶 G 薄层层析43 实验十三：植物材料中总黄酮的提纯与鉴定44 实 验 十 四 ： IEF/SDS-PAGE 双 向 电 泳 分 离 鉴 定 蛋 白 质 45 附 录 49 一、实验室主要仪器使用操作规程与注意事项49 二、常用缓冲溶液的配制55 三、硫酸铵饱和度的常用表60 生物化学实验须知 1．实验室规则 (1) 实验课必须提前 5 分钟到实验室,不迟到,不早退，应自觉遵守课堂纪律。 (2) 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约, 应特别注意保持药品和试剂的纯 净, 严防混杂污染。 (3) 实验台、试剂药品架必须保持整洁, 仪器药品摆放井然有序。实验完毕,需将药品、 试剂排列整齐, 仪器洗净倒置放好, 实验台面抹拭干净, 经教师验收仪器后, 方可离开实验 室。 (4) 使用和洗涤仪器时, 应小心谨慎, 防止损坏仪器。使用精密仪器时, 应严格遵守操作 规程, 发现故障应立即报告教师, 不要自己动手检修。 (5) 在实验过程中要听从教师的指导, 严肃认真地按操作规程进行实验, 并简要、准确 地将实验结果和数据记录在实验记录本上。课后写出实验报告, 由课代表收齐交给教师。 (6)仪器损坏时, 应如实向教师报告, 真填写损坏仪器登记表, 然后补偿一定金额。 (7)每次实验课安排同学轮流值日, 值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。 2．实验记录 实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写
在记录本上。实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。 实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验中观察到的 现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。原始 记录必须准确、简练、清楚。 3．实验报告的书写 实验结束后,应及时整理和总结实验结果, 写出实验报告。 （1） 标题 标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验组号、实验者及同组者姓名、实验 室条件。 （2） 实验目的 （3） 实验原理 应简述基本原理，不要完全照抄实验指导书。 （4）操作步骤 操作步骤 (或方法)可以采用流程图的方式或自行设计的表格来表达。 （5） 实验结果 将实验中的现象、数据进行整理、分析，得出相应的结论。建议尽量使用图表法来表示 实验结果，这样可以使实验结果清楚明了。 （6） 讨论 包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的 改进意见等。 4．生物化学实验课评分标准 ◼ 实验预习情况（10%） ◼ 实验操作情况（20%） ◼ 实验报告情况（30%） ◼ 实验考试成绩（40%） 实验室一些常用知识介绍 一．玻璃仪器的洗涤及一些常用的洗涤剂 1. 玻璃仪器的洗涤 （1）新购买的玻璃仪器, 首先用自来水洗去表面灰垢, 然后用洗衣粉刷洗, 自来水冲净后, 浸泡在 1%~2% 盐酸溶液中过夜以除去玻璃表面的碱性物质。最后, 用自来水冲洗干净, 并 用蒸馏水冲洗 2 次。 （2）对于使用过的玻璃仪器, 应先用自来水冲洗, 再用毛刷蘸取洗衣粉刷洗。用自来水充分 冲洗后再用蒸馏水冲洗 2 次。凡洗净的玻璃仪器壁上都不应带有水珠, 否则表示尚未洗净, 需重新洗涤。 （3）比较脏的仪器或不便刷洗的仪器, 使用前应用流水冲洗, 以除去粘附物, 如果仪器上有 凡士林或其他油污, 应先用软纸擦除, 再用有机溶剂擦净，最后用自来水冲洗。待仪器晾干 后, 放入铬酸洗液中浸泡过夜。取出后用自来水充分冲洗, 再用蒸馏水冲洗 2 次。 （4）普通玻璃仪器可在烘箱内烘干, 但定量的玻璃仪器如吸管、滴定管、量筒、容量瓶等 不能加热, 应晾干备用。另外, 分光光度计中的比色杯的四壁是用特殊胶水粘合而成, 受热
在记录本上。实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。 实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验中观察到的 现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。原始 记录必须准确、简练、清楚。 3．实验报告的书写 实验结束后,应及时整理和总结实验结果, 写出实验报告。 （1） 标题 标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验组号、实验者及同组者姓名、实验 室条件。 （2） 实验目的 （3） 实验原理 应简述基本原理，不要完全照抄实验指导书。 （4）操作步骤 操作步骤 (或方法)可以采用流程图的方式或自行设计的表格来表达。 （5） 实验结果 将实验中的现象、数据进行整理、分析，得出相应的结论。建议尽量使用图表法来表示 实验结果，这样可以使实验结果清楚明了。 （6） 讨论 包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的 改进意见等。 4．生物化学实验课评分标准 ◼ 实验预习情况（10%） ◼ 实验操作情况（20%） ◼ 实验报告情况（30%） ◼ 实验考试成绩（40%） 实验室一些常用知识介绍 一．玻璃仪器的洗涤及一些常用的洗涤剂 1. 玻璃仪器的洗涤 （1）新购买的玻璃仪器, 首先用自来水洗去表面灰垢, 然后用洗衣粉刷洗, 自来水冲净后, 浸泡在 1%~2% 盐酸溶液中过夜以除去玻璃表面的碱性物质。最后, 用自来水冲洗干净, 并 用蒸馏水冲洗 2 次。 （2）对于使用过的玻璃仪器, 应先用自来水冲洗, 再用毛刷蘸取洗衣粉刷洗。用自来水充分 冲洗后再用蒸馏水冲洗 2 次。凡洗净的玻璃仪器壁上都不应带有水珠, 否则表示尚未洗净, 需重新洗涤。 （3）比较脏的仪器或不便刷洗的仪器, 使用前应用流水冲洗, 以除去粘附物, 如果仪器上有 凡士林或其他油污, 应先用软纸擦除, 再用有机溶剂擦净，最后用自来水冲洗。待仪器晾干 后, 放入铬酸洗液中浸泡过夜。取出后用自来水充分冲洗, 再用蒸馏水冲洗 2 次。 （4）普通玻璃仪器可在烘箱内烘干, 但定量的玻璃仪器如吸管、滴定管、量筒、容量瓶等 不能加热, 应晾干备用。另外, 分光光度计中的比色杯的四壁是用特殊胶水粘合而成, 受热
后会散架, 所以也不能烘干。 对疑有传染性的样品 ( 如肝炎病人的血清 ), 其容器应先消毒再清洗。盛过剧毒药物或 放射性同位素物质的容器, 应先经过专门处理后再清洗。 2. 一些常用的洗涤剂 a. 肥皂水或洗衣粉溶液 这是最常用的洗涤剂, 主要是利用其乳化作用以除去污垢, 一般玻璃仪器均可用其刷洗。 b. 铬酸洗液 ( 重铬酸钾一硫酸洗液 ) 铬酸洗液广泛用于玻璃仪器的洗涤, 其清洁效力来自于它的强氧化性 (6 价铬) 和强酸性。 铬酸洗液具有强腐蚀性, 使用时应注意安全。铬酸洗液可反复使用多次, 如洗液由红棕色变 为绿色或过于稀释则不宜再用。 c. 5%~10% 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na2) 溶液: 加热煮沸, 利用 ED-TA 和金属离子的 强配位效应, 可去除玻璃器皿内部钙镁盐类的白色沉淀和不易 溶解的重金属盐类。 d. 45% 的尿素洗液: 是蛋白质的良好溶剂, 适用于洗涤盛蛋白质制剂血样的容器。 e.乙醇一硝酸混合液 用于清洗一般方法难于洗净的有机物, 最适合于洗涤滴定管。 二．生物化学常用缓冲液 1. 磷酸盐缓冲液 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂, 由于它们是二级解离, 有 2 个 pka 值, 所以用它们配制的缓冲液, pH 范围最宽： NaH2P04：pKa1=2.12, pKa2=7.21 Na2HP04：pKa1=7.21, pKa2=12.32 配酸性缓冲液：用 NaH2P04, pH 值为 1~4 。 配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐, pH 值为 6~8。 配碱性缓冲液：用 Na2HP04, pH 值为 10~12 。 磷酸盐缓冲液的优点为： ① 容易配制成各种浓度的缓冲液; ② 适用的 pH 范围宽; ③ pH 受温度的影响小; ④ 缓冲液稀释后 pH 变化小, 如稀释 10 倍后 pH 的变化小于 0.1 。 其缺点为： ①易与常见的 Ca2+、 Mg2+以及重金属离子缔合生成沉淀; ②会抑制某些生物化学过程, 如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 2.Tris 缓冲液( 三羟甲基氨基甲烷) Tris 缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多, 有超过磷酸盐缓冲液的趋势, 如在 SDS- 聚丙烯酷胶凝胶电泳中己都使用 Tris 缓冲液, 而很少再用磷酸盐。 Tris 缓冲液的常用有效 pH 范围是在 " 中性 " 范围 , 例如 Tris-HCl 缓冲液 pH 值为 7.5~8.5 Tris- 磷酸盐缓冲液 pH 值为 5.0~9.0 Tris-HCl 缓冲液的优点是： ① 因为 Tris 碱的碱性较强 , 所以可以只用这一种缓冲体系, 配制 pH 范围由酸性到碱性 的大范围 pH 值的缓冲液;
后会散架, 所以也不能烘干。 对疑有传染性的样品 ( 如肝炎病人的血清 ), 其容器应先消毒再清洗。盛过剧毒药物或 放射性同位素物质的容器, 应先经过专门处理后再清洗。 2. 一些常用的洗涤剂 a. 肥皂水或洗衣粉溶液 这是最常用的洗涤剂, 主要是利用其乳化作用以除去污垢, 一般玻璃仪器均可用其刷洗。 b. 铬酸洗液 ( 重铬酸钾一硫酸洗液 ) 铬酸洗液广泛用于玻璃仪器的洗涤, 其清洁效力来自于它的强氧化性 (6 价铬) 和强酸性。 铬酸洗液具有强腐蚀性, 使用时应注意安全。铬酸洗液可反复使用多次, 如洗液由红棕色变 为绿色或过于稀释则不宜再用。 c. 5%~10% 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na2) 溶液: 加热煮沸, 利用 ED-TA 和金属离子的 强配位效应, 可去除玻璃器皿内部钙镁盐类的白色沉淀和不易 溶解的重金属盐类。 d. 45% 的尿素洗液: 是蛋白质的良好溶剂, 适用于洗涤盛蛋白质制剂血样的容器。 e.乙醇一硝酸混合液 用于清洗一般方法难于洗净的有机物, 最适合于洗涤滴定管。 二．生物化学常用缓冲液 1. 磷酸盐缓冲液 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂, 由于它们是二级解离, 有 2 个 pka 值, 所以用它们配制的缓冲液, pH 范围最宽： NaH2P04：pKa1=2.12, pKa2=7.21 Na2HP04：pKa1=7.21, pKa2=12.32 配酸性缓冲液：用 NaH2P04, pH 值为 1~4 。 配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐, pH 值为 6~8。 配碱性缓冲液：用 Na2HP04, pH 值为 10~12 。 磷酸盐缓冲液的优点为： ① 容易配制成各种浓度的缓冲液; ② 适用的 pH 范围宽; ③ pH 受温度的影响小; ④ 缓冲液稀释后 pH 变化小, 如稀释 10 倍后 pH 的变化小于 0.1 。 其缺点为： ①易与常见的 Ca2+、 Mg2+以及重金属离子缔合生成沉淀; ②会抑制某些生物化学过程, 如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 2.Tris 缓冲液( 三羟甲基氨基甲烷) Tris 缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多, 有超过磷酸盐缓冲液的趋势, 如在 SDS- 聚丙烯酷胶凝胶电泳中己都使用 Tris 缓冲液, 而很少再用磷酸盐。 Tris 缓冲液的常用有效 pH 范围是在 " 中性 " 范围 , 例如 Tris-HCl 缓冲液 pH 值为 7.5~8.5 Tris- 磷酸盐缓冲液 pH 值为 5.0~9.0 Tris-HCl 缓冲液的优点是： ① 因为 Tris 碱的碱性较强 , 所以可以只用这一种缓冲体系, 配制 pH 范围由酸性到碱性 的大范围 pH 值的缓冲液;
② 对生物化学过程干扰很小, 不与钙离子及重金属离子发生沉淀。 其缺点是： ①缓冲液的 pH 值受溶液浓度影响较大, 缓冲液稀释 10 倍 , pH 值的变化大于 0.1; ②温度效应大, 温度变化对缓冲液 pH 值的影响很大, 例如 4℃时缓冲液的 pH 值为 8.4, 则 37 ℃时的 pH 值为 7.4, 所以一定要在使用温度下进行配制, 室温下配制的 Tris-HCl 缓冲液不能用于 0~4℃; ③易吸收空气中的 C02, 所以配制的缓冲液要盖严密封; ④此缓冲液对某些 pH 电极发生一定的干扰作用, 所以要使用与 Tris 溶液具有兼容性的电 极。 3. 硼酸盐缓冲液 常用的有效 pH 范围是：pH 值为 8.5~10.0, 因而它是碱性范围内最常用的缓冲液, 其优点 是配制方便, 只使用一种试剂, 缺点是能与很多代谢产物形成络合物, 尤其是能与糖类的短 基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。 4. 氨基酸缓冲液 此缓冲液使用的范围宽, 可用于 pH 值为 2.0~11.0, 例如最常用的有： 甘氨酸 -HCl 缓冲液：pH 值为 2.0~5.0 。 甘氨酸 -NaOH 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0 。 甘氨酸 -Tris 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0( 此缓冲液用于广泛使用的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶 电泳的电极缓冲液 ) 。 组氨酸缓冲液：pH 值为 5.5~6.5 。 甘氨酰胺(glycine amide) 缓冲液：pH 值为 7.8~8.8 。 甘氨酰甘氨酸 (glycylglycine 〉缓冲液：pH 值为 8.0~9.0 。 此类缓冲体系的优点是：为细胞组分和各种提取液提供更接近的天然环境。 其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似, 也会干扰某些生物化学反应过程, 如代谢过 程等; ②试剂的价格较高。 三．pH 值的测定 测定溶液 pH 值通常有两种方法, 最简便但较粗略的方法是用 pH 试纸, 分为广泛和 精密 pH 试纸两种。 精确测定溶液 pH 值要使用 pH 计, 其精确度可达 0.005 个 pH 单位, 关键是要正确 选用和校对 pH 电极。过去是使用两个电极, 即玻璃电极和参比电极, 现在它们已淘汰, 被 两种电极合一的复合电极所代替。 玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感, 其头部为一薄玻璃泡, 内装有 0.lmol/L HCl, 上 部由银 -氯化银电极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时, 薄玻璃泡内外两侧的电位 差取决于溶液的 pH 值, 即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度 ( 活 度 ) 的变 化而变化。 参比电极的功能是提供一个恒定的电位, 作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位差 的参照。常用的参比电极是甘汞电极 (Hg/HgCl) 或银 -氯化银电极 (Ag/AgCl) 。参比电极 电位是氯离子浓度的函数, 因而电极内充以 4mol/L KCl 或饱和 KC1, 以保持恒定的氯离 子浓度和恒定的电极电位。使用饱和 KCl 是为使电极内沉积有部分 KCl 结晶, 以使 KCl 的饱和浓度不受温度和湿度的影响。 现在 pH 值测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极, 即将它们共同组装在
② 对生物化学过程干扰很小, 不与钙离子及重金属离子发生沉淀。 其缺点是： ①缓冲液的 pH 值受溶液浓度影响较大, 缓冲液稀释 10 倍 , pH 值的变化大于 0.1; ②温度效应大, 温度变化对缓冲液 pH 值的影响很大, 例如 4℃时缓冲液的 pH 值为 8.4, 则 37 ℃时的 pH 值为 7.4, 所以一定要在使用温度下进行配制, 室温下配制的 Tris-HCl 缓冲液不能用于 0~4℃; ③易吸收空气中的 C02, 所以配制的缓冲液要盖严密封; ④此缓冲液对某些 pH 电极发生一定的干扰作用, 所以要使用与 Tris 溶液具有兼容性的电 极。 3. 硼酸盐缓冲液 常用的有效 pH 范围是：pH 值为 8.5~10.0, 因而它是碱性范围内最常用的缓冲液, 其优点 是配制方便, 只使用一种试剂, 缺点是能与很多代谢产物形成络合物, 尤其是能与糖类的短 基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。 4. 氨基酸缓冲液 此缓冲液使用的范围宽, 可用于 pH 值为 2.0~11.0, 例如最常用的有： 甘氨酸 -HCl 缓冲液：pH 值为 2.0~5.0 。 甘氨酸 -NaOH 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0 。 甘氨酸 -Tris 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0( 此缓冲液用于广泛使用的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶 电泳的电极缓冲液 ) 。 组氨酸缓冲液：pH 值为 5.5~6.5 。 甘氨酰胺(glycine amide) 缓冲液：pH 值为 7.8~8.8 。 甘氨酰甘氨酸 (glycylglycine 〉缓冲液：pH 值为 8.0~9.0 。 此类缓冲体系的优点是：为细胞组分和各种提取液提供更接近的天然环境。 其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似, 也会干扰某些生物化学反应过程, 如代谢过 程等; ②试剂的价格较高。 三．pH 值的测定 测定溶液 pH 值通常有两种方法, 最简便但较粗略的方法是用 pH 试纸, 分为广泛和 精密 pH 试纸两种。 精确测定溶液 pH 值要使用 pH 计, 其精确度可达 0.005 个 pH 单位, 关键是要正确 选用和校对 pH 电极。过去是使用两个电极, 即玻璃电极和参比电极, 现在它们已淘汰, 被 两种电极合一的复合电极所代替。 玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感, 其头部为一薄玻璃泡, 内装有 0.lmol/L HCl, 上 部由银 -氯化银电极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时, 薄玻璃泡内外两侧的电位 差取决于溶液的 pH 值, 即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度 ( 活 度 ) 的变 化而变化。 参比电极的功能是提供一个恒定的电位, 作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位差 的参照。常用的参比电极是甘汞电极 (Hg/HgCl) 或银 -氯化银电极 (Ag/AgCl) 。参比电极 电位是氯离子浓度的函数, 因而电极内充以 4mol/L KCl 或饱和 KC1, 以保持恒定的氯离 子浓度和恒定的电极电位。使用饱和 KCl 是为使电极内沉积有部分 KCl 结晶, 以使 KCl 的饱和浓度不受温度和湿度的影响。 现在 pH 值测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极, 即将它们共同组装在