《发酵工程》课程教学资源（讲义）第六章 透明质酸发酵过程优化

生长和发酵较好的原因之一。但菌株不同,情况可能不一样,如姚敏杰等发现对于马链球菌 ( Streptococcus equi)N2506,蛋白胨是最好的氮源 表6-2-8培养基的不同氮源组成对透明质酸产量的影响 氮源(10gL-) 透明质酸/L1生物量/gL YE 0.43 0.09 0.18 0.10 Cystine 0.14 0.20 0.37 SCHP 0.11 0.14 YE(5g. L )+BE(5g.L-)0.13 0.26 YE(gL')Pep(5g. L-)0.23 0.35 BE(Sg. L-)+Pep(5g. L-) 0.25 (NH4)2SO4(2g. L-) 0.03 0.05 对照 0.06 0.08 注∴YE,酵母膏;BE,牛肉膏;CSL,玉米浆;Pep,蛋白胨;SCHP,豆饼水解液 (二)酵母粉浓度对透明质酸发酵的影响 如表6-2-9所示,酵母粉浓度增加,对细胞生长、葡萄糖消耗和透明质酸生产均有促进作 用。当其浓度为20gL时,透明质酸的含量、细胞干重、细胞产率均达到最大值,残糖最低。 继续提高酵母粉的浓度,残糖升高,细胞干重和透明质酸都逐渐下降,但透明质酸产率反而 上升。表明虽然透明质酸产量随酵母粉浓度的继续升高而下降,但却有更大比例的碳源转化 为透明质酸。 Amstrong等在对一株链球菌进行研究后认为,在菌体生长阶段,生长代谢和产 物合成之间对碳源和能量的利用存在着竞争。可以认为酵母粉中含有更有利于透明质酸合成 的因子,使得透明质酸产率随酵母粉浓度的增多而不断提高。因此,在以后的实验中选用酵 母粉作为氮源,浓度20g/L 表6-2-9酵母粉浓度对发酵结果的影响 酵母粉/gL110 剩余葡萄糖/gL124421.216418221422.8 生物量/gL1 0.760.911.351.161.000.90 细胞产率g10.0340.0360.0440.0410.100.038 透明质酸/gL10.300.340.410.400.390.38 透明质酸产率/gg10.01400130.0130.0140.0160.016 注:初始葡萄糖浓度为468g/L。 (三)碳源种类对发酵的影响 不同微生物对碳源的利用情况不同。图6-2-2为H23菌株利用几种常见碳源合成透明质酸 的情况。以葡萄糖作为碳源,透明质酸产量最髙,其后依次是蔗糖和麦芽糖。而果糖、木糖、 半乳糖等利用情况不妤。考虑到硏究的方便,选用葡萄糖作为碳源

11 生长和发酵较好的原因之一。但菌株不同，情况可能不一样，如姚敏杰等发现对于马链球菌 (Streptococcus equi) N2506，蛋白胨是最好的氮源。 表6-2-8 培养基的不同氮源组成对透明质酸产量的影响 氮源 (10gL -1 ) 透明质酸 /gL -1 生物量 /gL -1 YE 0.29 0.43 BE 0.09 0.18 Pep 0.05 0.10 Cystine 0.03 0.14 CSL 0.20 0.37 SCHP 0.11 0.14 YE(5gL -1 )+BE(5gL -1 ) 0.13 0.26 YE(5gL -1 )+Pep(5gL -1 ) 0.23 0.35 BE(5gL -1 )+Pep(5gL -1 ) 0.10 0.25 (NH4)2SO4 (2gL -1 ) 0.03 0.05 对照 0.06 0.08 注∶YE，酵母膏；BE，牛肉膏；CSL，玉米浆；Pep，蛋白胨；SCHP，豆饼水解液 (二)酵母粉浓度对透明质酸发酵的影响 如表6-2-9所示，酵母粉浓度增加，对细胞生长、葡萄糖消耗和透明质酸生产均有促进作 用。当其浓度为20 g/L时，透明质酸的含量、细胞干重、细胞产率均达到最大值，残糖最低。 继续提高酵母粉的浓度，残糖升高，细胞干重和透明质酸都逐渐下降，但透明质酸产率反而 上升。表明虽然透明质酸产量随酵母粉浓度的继续升高而下降，但却有更大比例的碳源转化 为透明质酸。Amstrong等在对一株链球菌进行研究后认为，在菌体生长阶段，生长代谢和产 物合成之间对碳源和能量的利用存在着竞争。可以认为酵母粉中含有更有利于透明质酸合成 的因子，使得透明质酸产率随酵母粉浓度的增多而不断提高。因此，在以后的实验中选用酵 母粉作为氮源，浓度20 g/L。 表6-2-9 酵母粉浓度对发酵结果的影响 酵母粉 /gL -1 10 15 20 25 30 35 剩余葡萄糖 /gL -1 24.4 21.2 16.4 18.2 21.4 22.8 生物量 /gL -1 0.76 0.91 1.35 1.16 1.00 0.90 细胞产率 /gg -1 0.034 0.036 0.044 0.041 0.10 0.038 透明质酸 /gL -1 0.30 0.34 0.41 0.40 0.39 0.38 透明质酸产率 /gg -1 0.014 0.013 0.013 0.014 0.016 0.016 注∶初始葡萄糖浓度为46.8 g/L。 (三)碳源种类对发酵的影响 不同微生物对碳源的利用情况不同。图 6-2-2 为 H23 菌株利用几种常见碳源合成透明质酸 的情况。以葡萄糖作为碳源，透明质酸产量最高，其后依次是蔗糖和麦芽糖。而果糖、木糖、 半乳糖等利用情况不好。考虑到研究的方便，选用葡萄糖作为碳源

025 0.15 0.l 葡萄糖果糖蔗糖木糖半乳糖麦芽糖 图6-2-2发酵培养基中不同碳源对透明质酸产量的影响 (四)葡萄糖浓度对发酵的影响 如图6-2-3所示。细胞干重和细胞产率随初糖浓度升高而下降,而透明质酸的产量及产率 则呈相反趋势。可以看出较低的初糖浓度有利菌体生长,促进碳源向菌体的转化。虽然随着 初糖浓度的升高糖消耗量不断增加(数据未给出),但细胞干重却不断下降,所以细胞产率也不 断下降;透明质酸产量和透明质酸产率随着初糖浓度的升高而升高,表明在较高的初糖浓度 下有更多的底物转化为产物 从代谢流角度来考虑,初糖浓度直接影响着碳源代谢的流向。初糖浓度较髙时,碳源更 多的流向产物的合成,只有较少比例用于合成菌体。随着发酵的进行,大量副产物的形成抑 制了菌体的生长和产物的形成,使得初糖浓度较高的条件下的残糖浓度也较高。根据以上分 析,认为采用40g/L的初糖浓度进行摇瓶发酵较为合适。 0.05 0.8 0.04 是0.6 来0.03 0.02 0.01 0.00 60 初始葡萄糖/gL 图6-2-3不同初糖浓度对菌体和产物的影响 ◆透明质酸;▲生物量;■Yps:*细胞产率 (五)Mg2对发酵的影响 在透明质酸的合成途径中,透明质酸合成酶是一个关键酶,它催化透明质酸的前体转化 成透明质酸,Mg2+的浓度对此酶的活性影响很大。表6-2-10列出了不同MgSO4浓度对透明质 酸发酵的影响。随着MgSO浓度的逐步增大,葡萄糖消耗增加。当MgSO4浓度从0.4g/L升 至2.0叽L时,透明质酸的产量逐渐达到最高,同时,细胞干重也达到最大值;继续增大浓度, 透明质酸的产量和细胞干重均开始下降

12 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 HA /gL-1 葡萄糖 果糖 蔗糖 木糖 半乳糖 麦芽糖 图6-2-2 发酵培养基中不同碳源对透明质酸产量的影响 (四)葡萄糖浓度对发酵的影响 如图6-2-3所示。细胞干重和细胞产率随初糖浓度升高而下降，而透明质酸的产量及产率 则呈相反趋势。可以看出较低的初糖浓度有利菌体生长，促进碳源向菌体的转化。虽然随着 初糖浓度的升高糖消耗量不断增加(数据未给出)，但细胞干重却不断下降，所以细胞产率也不 断下降；透明质酸产量和透明质酸产率随着初糖浓度的升高而升高，表明在较高的初糖浓度 下有更多的底物转化为产物。 从代谢流角度来考虑，初糖浓度直接影响着碳源代谢的流向。初糖浓度较高时，碳源更 多的流向产物的合成，只有较少比例用于合成菌体。随着发酵的进行，大量副产物的形成抑 制了菌体的生长和产物的形成，使得初糖浓度较高的条件下的残糖浓度也较高。根据以上分 析，认为采用40 g/L的初糖浓度进行摇瓶发酵较为合适。 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 20 30 40 50 60 初始葡萄糖 /gL -1 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 HA、生物量 / gL-1 Yx/s Yp/s /gg-1 图6-2-3 不同初糖浓度对菌体和产物的影响 ◆ 透明质酸；▲ 生物量；■ Yp/s；＊ 细胞产率 (五)Mg2+对发酵的影响 在透明质酸的合成途径中，透明质酸合成酶是一个关键酶，它催化透明质酸的前体转化 成透明质酸，Mg2+的浓度对此酶的活性影响很大。表 6-2-10 列出了不同 MgSO4 浓度对透明质 酸发酵的影响。随着 MgSO4 浓度的逐步增大，葡萄糖消耗增加。当 MgSO4 浓度从 0.4 g/L 升 至 2.0 g/L 时，透明质酸的产量逐渐达到最高，同时，细胞干重也达到最大值；继续增大浓度， 透明质酸的产量和细胞干重均开始下降

表6-2-10MgSO4对透明质酸发酵的影响 MgSO7HO/gL0.40.81.21.62.0242.8323.6 剩余葡萄糖/gL116-49111041048074546-4234 生物量/gL 1.161.201.171.251.331.471.201.321.22 透明质酸/gL10.150. 0.230.270.320.300.280.280.28 透明质酸产率/gg10.0100.00970.01200140.0140.013001100110.01 (六) Streptococcus zooepidemicus F23菌株发酵培养基组成的正交优化 以上考察了单因素对发酵的影响,但由于生化实验的特点,往往各个实验批次之间的差 别较大,较优工艺条件的确定需要对各因素进行综合考察。正交试验设计是用正交表来安排 少量的试验,从多个因素中分析出主次,以及它们对试验的影响规律,从而找出较优的工艺 条件。本实验选择了对菌体生长和产物合成有较大影响的酵母粉、葡萄糖以及Mg2+,安排了 三因素三水平的正交实验方案,表6-2-11为正交试验因素水平表,表6-2-12正交实验方案和 实验结果的分析,表6-2-13为正交试验方差分析 由方差分析可知三因素中酵母粉是影响较为显著的因素。从表6-2-12的直观分析中可以 看出,三个因素对发酵影响的显著性主次顺序为C→A→B。可以看出最佳配方为A2B2C2, 葡萄糖浓度为40gL,MgSO47HO浓度为2.0g/L,酵母粉浓度为20g/L 表6-2-11正交试验因素水平表 因子MgSO47HOgL葡萄糖/gL酵母粉/gL1 18 2.0 表62-12正交实验方案和实验结果的分析 run MgSO4THO葡萄糖酵母粉透明质酸透明质酸产率 0.307 0.0942 0.241 0.0581 0.251 0.0630 0.0456 0.236 0.0557 0.258 0.0666 8 0.136 0.0185 0.172 0.0296 0.509 ∑=1938 ∑=0.4466 0.701 0.657 0.801 0.566 0.649 0.628 K 0.399 0.259 0.641 K32 0.320 0.421 0.394 1252 1.295

13 表6-2-10 MgSO4对透明质酸发酵的影响 MgSO47H2O / gL -1 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 3.6 剩余葡萄糖 / gL -1 16-4-9 11.1 10.4 10.4 8.0 7.4 5.4 6-4-2 3.4 生物量 / gL -1 1.16 1.20 1.17 1.25 1.33 1.47 1.20 1.32 1.22 透明质酸 / gL -1 0.15 0.18 0.23 0.27 0.32 0.30 0.28 0.28 0.28 透明质酸产率 / gg -1 0.010 0.0097 0.012 0.014 0.014 0.013 0.011 0.011 0.011 (六) Streptococcus zooepidemicus H23 菌株发酵培养基组成的正交优化 以上考察了单因素对发酵的影响，但由于生化实验的特点，往往各个实验批次之间的差 别较大，较优工艺条件的确定需要对各因素进行综合考察。正交试验设计是用正交表来安排 少量的试验，从多个因素中分析出主次，以及它们对试验的影响规律，从而找出较优的工艺 条件。本实验选择了对菌体生长和产物合成有较大影响的酵母粉、葡萄糖以及 Mg2+，安排了 三因素三水平的正交实验方案，表 6-2-11 为正交试验因素水平表，表 6-2-12 正交实验方案和 实验结果的分析，表 6-2-13 为正交试验方差分析。 由方差分析可知三因素中酵母粉是影响较为显著的因素。从表 6-2-12 的直观分析中可以 看出，三个因素对发酵影响的显著性主次顺序为 C→A→B。可以看出最佳配方为 A2B2C2，即 葡萄糖浓度为 40 g/L，MgSO47H2O 浓度为 2.0 g/L，酵母粉浓度为 20 g/L。 表 6-2-11 正交试验因素水平表 水平 因子 MgSO47H2O /gL -1 葡萄糖 /gL -1 酵母粉 /gL -1 1 1.8 30 15 2 2.0 40 20 3 2.2 50 25 表 6-2-12 正交实验方案和实验结果的分析 run MgSO47H2O 葡萄糖 酵母粉 透明质酸 透明质酸产率 1 1 1 1 0.123 0.0151 2 1 2 2 0.307 0.0942 3 1 3 3 0.241 0.0581 4 2 1 3 0.251 0.0630 5 2 2 1 0.214 0.0456 6 2 3 2 0.236 0.0557 7 3 1 2 0.258 0.0666 8 3 2 3 0.136 0.0185 9 3 3 1 0.172 0.0296 K1 0.671 0.632 0.509 =1.938 =0.4466 K2 0.701 0.657 0.801 K3 0.566 0.649 0.628 K1 2 0.450 0.399 0.259 K2 2 0.491 0.432 0.641 K3 2 0.320 0.421 0.394 Ki 2 1.262 1.252 1.295

表6-2-13正交试验方差分析 误差来源平方和自由度方差F显著性 MgSO…7H2O0.0034 0.00170.292 葡萄糖 0.0001 0.000050.009 酵母粉 0.0144 0.00721.255 误差 0.0114 0.0057 总和 0.0293 五、培养条件对透明质酸发酵的影响 (一)温度对透明质酸发酵的影响 如表6-2-14所示。发酵温度为33℃时,透明质酸产量最高,达0.47g/L。而细胞干重却在 高温下更高,39℃时达1.20g。从产率系数上看,33℃C时,透明质酸产率最高;相应地,39 ℃时,细胞产率最高。可以看出,高温有利菌体生长,碳源更多地转化为菌体,但不适合透 明质酸的形成。 表6-2-14不同温度对透明质酸发酵的影响 33 剩余葡萄糖/gL 生物量/gL 0.49 0.46 0.76 透明质酸/gL1 0.47 0.34 0.31 0.30 透明质酸产率/gg10.01370.0211001570.01460.014 (二)供氧对透明质酸生产的影响 Streptococcus zooepidemicus H3是一株兼性厌氧菌,供氧状况直接影响其生长代谢及代谢 调控方式。本实验采用不同的装液量以及厌氧的方式,考察了不同供氧对发酵的影响,结果 如表6-2-15所示。实验结果显示,并非是供氧愈充分,菌体生长和产物形成愈好。当500mL 三角瓶装液量为40mL时,透明质酸的产量出现一个峰值,少于40mL或多于40mL,透明质酸 的产量均会下降。但对于细胞干重来说,却有一个与透明质酸相反的趋势,即在40mL时,细 胞干重最低。说明控制合适的通风量可以提高透明质酸产量及其产率系数。厌氧发酵时菌体 也可大量生长,并合成较多的透明质酸,但与供氧条件合适时的发酵结果相比有一定差距 表6-2-15装液量对透明质酸发酵的影响 培养基体积/mL 070厌氧培养 剩余葡萄糖/gLl 22.2 生物量/gL 0.760.710.680.841.081.110.93 细胞产率/gg 0.0570.0480.0360.0470.0590.0580.054 透明质酸/gL 0.180.200.290.230.210.210.22 透明质酸产率/gg10.0130.0130015001300110.010700129 通风发酵能获得较高的透明质酸浓度和产率系数的原因,可能是由于氧的存在,使中间 产物丙酮酸更多地被氧化成乙酸,从而得到更多的能量。由于在摇瓶条件下不能对发酵的pH 值进行较好的控制,而发酵过程中产生大量乙酸和乳酸,抑制了菌体的生长和代谢,因此

14 表 6-2-13 正交试验方差分析 误差来源 平方和 自由度 方差 F 显著性 MgSO47H2O 0.0034 2 0.0017 0.292 葡萄糖 0.0001 2 0.00005 0.009 酵母粉 0.0144 2 0.0072 1.255 * 误差 0.0114 2 0.0057 总和 0.0293 7 F0.25(2.2)=3.00 五、培养条件对透明质酸发酵的影响 (一)温度对透明质酸发酵的影响 如表6-2-14所示。发酵温度为33℃时，透明质酸产量最高，达0.47 g/L。而细胞干重却在 高温下更高，39 ℃时达1.20 g/L。从产率系数上看，33℃时，透明质酸产率最高；相应地，39 ℃时，细胞产率最高。可以看出，高温有利菌体生长，碳源更多地转化为菌体，但不适合透 明质酸的形成。 表6-2-14 不同温度对透明质酸发酵的影响 温度 /℃ 30 33 35 37 39 剩余葡萄糖 /gL -1 9.0 7.7 7.7 8.6 9.5 生物量 /gL -1 0.49 0.46 0.56 0.76 1.20 透明质酸 /gL -1 0.29 0.47 0.34 0.31 0.30 透明质酸产率 /gg -1 0.0137 0.0211 0.0157 0.0146 0.0144 (二)供氧对透明质酸生产的影响 Streptococcus zooepidemicus H23是一株兼性厌氧菌，供氧状况直接影响其生长代谢及代谢 调控方式。本实验采用不同的装液量以及厌氧的方式，考察了不同供氧对发酵的影响，结果 如表6-2-15所示。实验结果显示，并非是供氧愈充分，菌体生长和产物形成愈好。当500 mL 三角瓶装液量为40 mL时，透明质酸的产量出现一个峰值，少于40 mL或多于40 mL，透明质酸 的产量均会下降。但对于细胞干重来说，却有一个与透明质酸相反的趋势，即在40 mL时，细 胞干重最低。说明控制合适的通风量可以提高透明质酸产量及其产率系数。厌氧发酵时菌体 也可大量生长，并合成较多的透明质酸，但与供氧条件合适时的发酵结果相比有一定差距。 表6-2-15 装液量对透明质酸发酵的影响 培养基体积 / mL 20 30 40 50 60 70 厌氧培养 剩余葡萄糖 /gL -1 26.6 25.1 20.9 22.2 21.6 20.8 22.8 生物量 /gL -1 0.76 0.71 0.68 0.84 1.08 1.11 0.93 细胞产率 /gg -1 0.057 0.048 0.036 0.047 0.059 0.058 0.054 透明质酸 /gL -1 0.18 0.20 0.29 0.23 0.21 0.21 0.22 透明质酸产率 /gg -1 0.013 7 0.013 6 0.015 0 0.013 0 0.011 5 0.0107 0.0129 通风发酵能获得较高的透明质酸浓度和产率系数的原因，可能是由于氧的存在，使中间 产物丙酮酸更多地被氧化成乙酸，从而得到更多的能量。由于在摇瓶条件下不能对发酵的 pH 值进行较好的控制，而发酵过程中产生大量乙酸和乳酸，抑制了菌体的生长和代谢，因此产

物浓度难以有很大提高 六、透明质酸摇瓶发酵过程曲线 图6-2-4为典型的摇瓶发酵过程曲线。可以看出,种子接入发酵培养基后约3h,细胞生长 开始进入对数生长期,约13h到达最高点09g/;透明质酸也表现出相同的趋势,发酵至12h 透明质酸产量达到最高,为0.37gL,表明透明质酸的形成与细胞生长是偶联的。此后,菌体 浓度和透明质酸的产量略有下降,葡萄糖的利用速度变缓。 旋34上端 ◆生物量 32 024681011416 图6-2-4H23菌株的摇瓶发酵过程曲线 七、透明质酸摇瓶补料发酵实验 在分析了透明质酸摇瓶发酵过程曲线的基础上,根据透明质酸的发酵特征,作者采用- 定总糖,不同时间分批加入的方法,考察了碳源供给方式的变化对摇瓶发酵的影响,结果见 表6-2-16。由表可知,简单的补料方式并不能促进透明质酸的发酵生产。初糖浓度高时,不仅 透明质酸最终产量高,而且透明质酸产率也高,但菌体生长却不好,同时细胞产率也比较低。 表6-2-16摇瓶发酵中分批和补料发酵对结果的影响 补料方式 方式1方式2方式3 剩余葡萄糖/gL1 36.3 26.0 生物量/gL 0.65 细胞产率/ggh 0.038 0.041 0.042 透明质酸/gL 0.43 0.41 透明质酸产率/gg1004100260017 方式1:初始葡萄糖468g/L 方式2:初始葡萄糖31.2g/,1oh补加156g/L的葡萄糖 方式3:初始葡萄糖156g/,5h和10h分别加入15.6g/_的葡萄糖

15 物浓度难以有很大提高。 六、透明质酸摇瓶发酵过程曲线 图6-2-4为典型的摇瓶发酵过程曲线。可以看出，种子接入发酵培养基后约3 h，细胞生长 开始进入对数生长期，约13h到达最高点0.9 g/L；透明质酸也表现出相同的趋势，发酵至12h， 透明质酸产量达到最高，为0.37 g/L，表明透明质酸的形成与细胞生长是偶联的。此后，菌体 浓度和透明质酸的产量略有下降，葡萄糖的利用速度变缓。 葡萄糖 /g L -1 生物量 /g L -1 HA /g L -1 t /h ▲ HA ■ 葡萄糖 ◆ 生物量 图6-2-4 H23菌株的摇瓶发酵过程曲线 七、透明质酸摇瓶补料发酵实验 在分析了透明质酸摇瓶发酵过程曲线的基础上，根据透明质酸的发酵特征，作者采用一 定总糖，不同时间分批加入的方法，考察了碳源供给方式的变化对摇瓶发酵的影响，结果见 表 6-2-16。由表可知，简单的补料方式并不能促进透明质酸的发酵生产。初糖浓度高时，不仅 透明质酸最终产量高，而且透明质酸产率也高，但菌体生长却不好，同时细胞产率也比较低。 表 6-2-16 摇瓶发酵中分批和补料发酵对结果的影响 补料方式 方式 1 方式 2 方式 3 剩余葡萄糖 /gL -1 36.3 31.2 26.0 生物量 /gL -1 0.40 0.65 0.88 细胞产率 /gg -1 0.038 0.041 0.042 透明质酸 /gL -1 0.43 0.41 0.35 透明质酸产率 /gg -1 0.041 0.026 0.017 方式 1∶初始葡萄糖 46.8 g/L 方式 2∶初始葡萄糖 31.2 g/L，10 h 补加 15.6 g/L 的葡萄糖 方式 3∶初始葡萄糖 15.6 g/L ，5 h 和 10 h 分别加入 15.6 g/L 的葡萄糖