《发酵工程》课程教学资源（讲义）第六章 透明质酸发酵过程优化

提取得率降低,而且会使透明质酸分子量降低。若存在对聚合链剪切的操作,透明质酸分子 可能会发生断裂。目前世界上有4个研究小组对有机溶剂法提取透明质酸进行了研究,发现 控制合适的pH、温度,分别将蛋白质、核酸等杂质去除,既能获得高纯度透明质酸产品,又 不会在提取过程中降低透明质酸分子量 3.环境条件对透明质酸安全性的影响 透明质酸生产的安全性包括生产过程的安全性和产品的安全性。不产任何毒素的生产菌 株,既可防止生产过程中偶然的泄漏造成对健康的伤害,也可大大降低后提取过程的成本。 一般的做法是先采用诱变的方法将菌种产生毒素的性能去除,然后再进行培养研究。 Ellwood、 高山健一郎等采用连续培养的方法,既可降低提取成本又可减少毒素的产生。菌体生长进入 静止期后,细胞开始产生不同的毒素,同时各种降解酶开始作用使菌体发生自溶,各种细胞 成分释放到培养基中,使得提取困难。在成分稳定的培养基中进行连续培养,可以大大减少 这些酶的表达。连续培养的另一个优点是细胞壁更新率较低,而细胞壁成分与透明质酸分离 困难,因此这是一个优点。 四、透明质酸生产中需要解决的问题 透明质酸在医学、医药和化妆品领域具有的广阔应用前景。作为一种商品,透明质酸的 质量和成本正成为制约透明质酸广泛应用的一个重要因素。发酵法生产透明质酸的成功是近 年来透明质酸生产研究取得的最重大的进展,但由于发酵法生产透明质酸的发展历史较短, 尚存在如下不足和需要解决的问题: 原料。原料成本是生产成本的重要部分,开发可以利用价格低廉和较粗放原料(包括各 级放大的种子所用的原料)的菌种是一个重要的应用研究方向 2.发酵过程的动力学。动力学是应用现代发酵技术的基础,对其进行研究,可以了解发 酵过程的规律,对生产过程进行优化和控制,以获得高底物转化率和高生产强度。但到目前 为止,关于透明质酸的发酵过程动力学,还没有相关的研究报道 3.发酵过程的优化与控制。透明质酸溶液具有极强的粘弹性,其发酵体系有着与一般体 系不同的流变学特性。已有的一些关于发酵法生产透明质酸的研究报道,主要集中于研究 些简单的发酵条件,对透明质酸发酵过程中的特殊现象没有进行深入的考察。如,搅拌、 氧浓度如何影响透明质酸发酵的过程和结果,氧在发酵过程中所起的作用等 4.工业化生产模式。透明质酸发酵生产的周期较短,仅采用单一的分批操作模式不一定 能得到最佳的工艺效果。而现有的研究多集中于分批发酵,虽然已有报道阐述连续培养生产 透明质酸的优点,但其能否应用于实际生产还有待于进一步研究。 5.发酵机理的探讨。已有研究表明仅10‰%左右的底物可以转化为透明质酸,但其原因何 在?是否可以采用一定的手段和方法来提高透明质酸生物合成的转化率?虽然有关透明质酸生 物合成机制的研究已进行到分子水平,但还没有关于提高透明质酸合成能力的理论和方法的 报道 五、本章主要内容 本章以兽疫链球菌( Streptococcus〓 zooepidemicus)H23为生产菌株,采用摇瓶和小型发酵罐 对该菌株的发酵条件进行研究,并根据该菌株细胞生长和产物合成的动力学特性提出其发酵 过程的动力学模型:通过对模拟发酵体系的流变学行为和混合、传质性能进行研究,深入探 讨搅拌和溶氧在发酵过程中的作用,提出搅拌溶氧控制策略并实验验证;对多种发酵模式进 行研究,采用奇异控制理论对补料发酵过程进行优化,并将多种发酵模式进行组合操作,提

6 提取得率降低，而且会使透明质酸分子量降低。若存在对聚合链剪切的操作，透明质酸分子 可能会发生断裂。目前世界上有 4 个研究小组对有机溶剂法提取透明质酸进行了研究，发现 控制合适的 pH、温度，分别将蛋白质、核酸等杂质去除，既能获得高纯度透明质酸产品，又 不会在提取过程中降低透明质酸分子量。 3．环境条件对透明质酸安全性的影响 透明质酸生产的安全性包括生产过程的安全性和产品的安全性。不产任何毒素的生产菌 株，既可防止生产过程中偶然的泄漏造成对健康的伤害，也可大大降低后提取过程的成本。 一般的做法是先采用诱变的方法将菌种产生毒素的性能去除，然后再进行培养研究。Ellwood、 高山健一郎等采用连续培养的方法，既可降低提取成本又可减少毒素的产生。菌体生长进入 静止期后，细胞开始产生不同的毒素，同时各种降解酶开始作用使菌体发生自溶，各种细胞 成分释放到培养基中，使得提取困难。在成分稳定的培养基中进行连续培养，可以大大减少 这些酶的表达。连续培养的另一个优点是细胞壁更新率较低，而细胞壁成分与透明质酸分离 困难，因此这是一个优点。 四、透明质酸生产中需要解决的问题 透明质酸在医学、医药和化妆品领域具有的广阔应用前景。作为一种商品，透明质酸的 质量和成本正成为制约透明质酸广泛应用的一个重要因素。发酵法生产透明质酸的成功是近 年来透明质酸生产研究取得的最重大的进展，但由于发酵法生产透明质酸的发展历史较短， 尚存在如下不足和需要解决的问题： 1．原料。原料成本是生产成本的重要部分，开发可以利用价格低廉和较粗放原料(包括各 级放大的种子所用的原料)的菌种是一个重要的应用研究方向。 2．发酵过程的动力学。动力学是应用现代发酵技术的基础，对其进行研究，可以了解发 酵过程的规律，对生产过程进行优化和控制，以获得高底物转化率和高生产强度。但到目前 为止，关于透明质酸的发酵过程动力学，还没有相关的研究报道。 3．发酵过程的优化与控制。透明质酸溶液具有极强的粘弹性，其发酵体系有着与一般体 系不同的流变学特性。已有的一些关于发酵法生产透明质酸的研究报道，主要集中于研究一 些简单的发酵条件，对透明质酸发酵过程中的特殊现象没有进行深入的考察。如，搅拌、溶 氧浓度如何影响透明质酸发酵的过程和结果，氧在发酵过程中所起的作用等。 4．工业化生产模式。透明质酸发酵生产的周期较短，仅采用单一的分批操作模式不一定 能得到最佳的工艺效果。而现有的研究多集中于分批发酵，虽然已有报道阐述连续培养生产 透明质酸的优点，但其能否应用于实际生产还有待于进一步研究。 5．发酵机理的探讨。已有研究表明仅 10%左右的底物可以转化为透明质酸，但其原因何 在?是否可以采用一定的手段和方法来提高透明质酸生物合成的转化率?虽然有关透明质酸生 物合成机制的研究已进行到分子水平，但还没有关于提高透明质酸合成能力的理论和方法的 报道。 五、本章主要内容 本章以兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)H23 为生产菌株，采用摇瓶和小型发酵罐 对该菌株的发酵条件进行研究，并根据该菌株细胞生长和产物合成的动力学特性提出其发酵 过程的动力学模型；通过对模拟发酵体系的流变学行为和混合、传质性能进行研究，深入探 讨搅拌和溶氧在发酵过程中的作用，提出搅拌溶氧控制策略并实验验证；对多种发酵模式进 行研究，采用奇异控制理论对补料发酵过程进行优化，并将多种发酵模式进行组合操作，提

高透明质酸生产效率,为工业化生产打下基础;最后对Sz0 epidemicus的代谢网络进行了分 析,根据理论计算结果,采用营养增强型培养基,实现透明质酸的高效生产。具体内容如下 1.以兽疫链球菌( Streptococcus zooepidemicus)H23为生产菌株,采用无血清、无BH(心 脑浸液)种子培养基及较为简单的发酵培养基,进行菌体生长和透明质酸合成的摇瓶发酵条 件研究。在此基础上,采用小型发酵罐进行S.〓00 epidemicus H23培养的研究,并对过程进行 优化。通过对透明质酸发酵过程动力学进行分析,扩展功能单元理论,提出透明质酸分批发 酵过程动力学数学模型,为补料培养及其优化控制提供理论基础 2.采用模拟体系,对透明质酸发酵过程的流变学行为进行研究,建立发酵过程流变学模 型。在一定环境条件下,考察透明质酸浓度、控制条件对混合和传质的影响,从流变学角度 探讨发酵机制,为反应器设计选型提供依据。以流变学研究为基础,对溶氧和搅拌在透明质 酸发酵生产中的作用进行细致的研究和分析,探讨氧的代谢途径及其影响透明质酸合成的作 用机理,提出透明质酸发酵生产的搅拌溶氧控制策略。 3.根据分批发酵动力学模型,对简单分批补料培养过程进行分析。采用奇异优化理论 以透明质酸最大产量为目标,对补料分批培养过程进行优化。采用不同的发酵模式对发酵生 产透明质酸进行研究,并以最大生产强度为目标硏究多种模式的组合操作的可行性,优化操 作过程,为工业化生产打下了基础。 4.采用代谢网络分析方法对 S. Zooepidemicus代谢网络通量进行研究,建立不同发酵条件 下的代谢网络模型,确定代谢模型中有关透明质酸合成的关键代谢节点的刚性,并对能量和 还原力在代谢过程中的作用进行探讨。以代谢网络分析为基础,通过实验确定S.〓0 epidemicus H23合成透明质酸的关键因子,并采用营养增强型培养基培养S.〓 zooepidemicus H23,减轻透 明质酸合成途径的抑制,提高透明质酸产量和对底物的转化率 第二节透明质酸摇瓶发酵条件的研究 、引言 荚膜是微生物在一定生长阶段合成的胞外覆盖物,以多糖为主要成分。1937年, Kendall 等发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜,其 后,又陆续有报道发现能合成透明质酸的微生物菌种。许多链球菌都可以合成以透明质酸多 糖为唯一成分的荚膜,使得链球菌(特别是对人体危害较小的C型)成为研究得最多的透明质酸 生产菌,已报道的有多种溶血性链球菌(A型)、兽疫链球菌C型)、马链球菌(C型)、粪马链球 菌(C型)、缺乳链球菌(C型)以及鸡霍乱杆菌(C型)等。其中A型为人体致病菌,C型则只能感 染畜类。许多年来虽然有不少学者研究发酵法生产透明质酸,并且在1983年,日本资生堂率 先成功开发出工业化规模发酵生产透明质酸的方法,但由于其具有巨大的商业价值,除专利 外,关于发酵法生产透明质酸的报道并不多 微生物的培养条件,对其生长代谢有着重要的影响。适宜的环境条件不仅有利于菌体的 生长,而且可以提高微生物对底物的利用能力,使代谢朝向有利于产物合成的方向进行。由 于 Streptococcus zooepidemicus对营养要求极为苛刻,已有的报道都表明,对其进行培养需要 以血清或BH( Brain heart Infusion)为培养基主要成分,特别是在种子培养阶段。为此,本节以 株能产透明质酸的 Streptococcus zooepidemicus H23为研究菌株,首先对种子培养基组成进 行了考察硏究,得到了无血清种子培养基;以此为基础采用摇瓶发酵的方式,对培养条件(培 养温度、供氧状况和培养基组成)进行了研究,得到了较好的透明质酸摇瓶发酵条件。 7

7 高透明质酸生产效率，为工业化生产打下基础；最后对 S. zooepidemicus 的代谢网络进行了分 析，根据理论计算结果，采用营养增强型培养基，实现透明质酸的高效生产。具体内容如下∶ 1．以兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus) H23 为生产菌株，采用无血清、无 BHI(心 脑浸液)的种子培养基及较为简单的发酵培养基，进行菌体生长和透明质酸合成的摇瓶发酵条 件研究。在此基础上，采用小型发酵罐进行 S. zooepidemicus H23 培养的研究，并对过程进行 优化。通过对透明质酸发酵过程动力学进行分析，扩展功能单元理论，提出透明质酸分批发 酵过程动力学数学模型，为补料培养及其优化控制提供理论基础。 2．采用模拟体系，对透明质酸发酵过程的流变学行为进行研究，建立发酵过程流变学模 型。在一定环境条件下，考察透明质酸浓度、控制条件对混合和传质的影响，从流变学角度 探讨发酵机制，为反应器设计选型提供依据。以流变学研究为基础，对溶氧和搅拌在透明质 酸发酵生产中的作用进行细致的研究和分析，探讨氧的代谢途径及其影响透明质酸合成的作 用机理，提出透明质酸发酵生产的搅拌溶氧控制策略。 3．根据分批发酵动力学模型，对简单分批补料培养过程进行分析。采用奇异优化理论， 以透明质酸最大产量为目标，对补料分批培养过程进行优化。采用不同的发酵模式对发酵生 产透明质酸进行研究，并以最大生产强度为目标研究多种模式的组合操作的可行性，优化操 作过程，为工业化生产打下了基础。 4．采用代谢网络分析方法对 S. zooepidemicus 代谢网络通量进行研究，建立不同发酵条件 下的代谢网络模型，确定代谢模型中有关透明质酸合成的关键代谢节点的刚性，并对能量和 还原力在代谢过程中的作用进行探讨。以代谢网络分析为基础，通过实验确定 S. zooepidemicus H23 合成透明质酸的关键因子，并采用营养增强型培养基培养 S. zooepidemicus H23，减轻透 明质酸合成途径的抑制，提高透明质酸产量和对底物的转化率。 第二节 透明质酸摇瓶发酵条件的研究 一、引言 荚膜是微生物在一定生长阶段合成的胞外覆盖物，以多糖为主要成分。1937 年，Kendall 等发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus 可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜，其 后，又陆续有报道发现能合成透明质酸的微生物菌种。许多链球菌都可以合成以透明质酸多 糖为唯一成分的荚膜，使得链球菌(特别是对人体危害较小的 C 型)成为研究得最多的透明质酸 生产菌，已报道的有多种溶血性链球菌(A 型)、兽疫链球菌(C 型)、马链球菌(C 型)、粪马链球 菌(C 型)、缺乳链球菌(C 型)以及鸡霍乱杆菌(C 型)等。其中 A 型为人体致病菌，C 型则只能感 染畜类。许多年来虽然有不少学者研究发酵法生产透明质酸，并且在 1983 年，日本资生堂率 先成功开发出工业化规模发酵生产透明质酸的方法，但由于其具有巨大的商业价值，除专利 外，关于发酵法生产透明质酸的报道并不多。 微生物的培养条件，对其生长代谢有着重要的影响。适宜的环境条件不仅有利于菌体的 生长，而且可以提高微生物对底物的利用能力，使代谢朝向有利于产物合成的方向进行。由 于 Streptococcus zooepidemicus 对营养要求极为苛刻，已有的报道都表明，对其进行培养需要 以血清或 BHI(Brain Heart Infusion)为培养基主要成分，特别是在种子培养阶段。为此，本节以 一株能产透明质酸的 Streptococcus zooepidemicus H23 为研究菌株，首先对种子培养基组成进 行了考察研究，得到了无血清种子培养基；以此为基础采用摇瓶发酵的方式，对培养条件(培 养温度、供氧状况和培养基组成)进行了研究，得到了较好的透明质酸摇瓶发酵条件

、种子培养基组成及培养条件对透明质酸发酵的影响 种子是进行发酵的基础,其品质的好坏对发酵生产起着关键的作用。生产中培养出的种 子应是:(1)生长活力强,移至发酵罐后能迅速生长,延滞期短;(2)生理状态稳定:(3)生物量 浓度能满足大容量发酵罐的要求。 (一)种子培养基中氮源种类及浓度对透明质酸发酵的影响 氮源种类的确定 种子培养基中不同氮源对种子液中细胞生长及摇瓶发酵情况的影响见表6-2-1。种子液中 细胞生长良好的,发酵培养时不一定能得到好的结果,表明细胞量多、但如果细胞合成透明 质酸的能力并未处于较佳的状态,最终不会得到较高的透明质酸产量。采用无机氮源(NH)SO4 作为种子培养基氮源,接入发酵培养基后透明质酸产量最低,可能是NH·对菌体有着一定的 毒害作用,或者是培养基中缺少一定的生长因子,致使种子生长不好。采用复合有机氮源 接入发酵培养基后其透明质酸产量好于单一的有机氮源,可能是因为不同有机氮源提供的不 同生长因子能够进行互补,利于细胞生长。在复合有机氮源中,牛肉膏和酵母粉各占氮源总 量50%的种子培养基,接入发酵培养基后透明质酸产量最高:牛肉膏和蛋白胨各占氮源50% 的其次;而蛋白胨和酵母粉各占氮源50%的,接入发酵培养基后其发酵结果与采用单一有机 氮源的发酵结果几乎相同。 表6-2-1种子培养基中的不同氮源组成对透明质酸发酵结果的影响(1) 氮源种子),B、P、、BB)()P以ABSQ 种子生物量/gL0.850.871.0 0.86 1.06 0.82 生物量/gLl150 1.38 发酵 透明质酸 0.15 0.14 0.22 /g L 注:BE,牛肉音 beef extract);Pep,蛋白胨( peptone):YE,酵母粉( yeast extract) 在上述实验的基础上,进一步考察了BHI培养基和种子培养基中复合有机氮源的浓度对 透明质酸发酵的影响,结果见表6-2-2。以BH培养基作为种子培养基,接入发酵培养基后透 明质酸产量并不高。因此,种子培养基采用牛肉膏和酵母粉为复合氮源。由于牛肉膏和酵母 粉复合氮源内含有大量的生长因子,可以推测这种复合氮源能够提供血清或BH所能提供的 生长因子,所以不加血清和BH的种子同样可以使细胞较好地生长,使得种子培养基的成本 有所降低 表6-2-2种子培养基中的不同氮源组成对透明质酸发酵结果的影响(2) YE(5g--)YE(5g- L-)Pep(5g.L- BHI Pep(5g. L") BE(5g.L') BE (5g. L") 透明质酸/gL 0.133 0.178 0.153 注:BE,牛肉膏 (beef extract):Pep,蛋白胨( peptone):YE,酵母粉( yeast extract) 2.氮源浓度的确定 考察由牛肉膏和酵母粉组成的复合氮源浓度对透明质酸发酵的影响,结果如表6-2-3所示 随着氮源浓度的升高,种子液中细胞干重随之升高。当氮源浓度达20g/L时,细胞干重也基 本稳定于最大值。此时透明质酸发酵也处于最佳状态。因此,在以后的硏究中选用酵母粉和 牛肉膏为复合氮源,浓度各为10g/L 表6-2-3种子培养基中氮源的不同浓度对发酵结果的影响

8 二、种子培养基组成及培养条件对透明质酸发酵的影响 种子是进行发酵的基础，其品质的好坏对发酵生产起着关键的作用。生产中培养出的种 子应是：(1)生长活力强，移至发酵罐后能迅速生长，延滞期短；(2)生理状态稳定；(3)生物量 浓度能满足大容量发酵罐的要求。 (一)种子培养基中氮源种类及浓度对透明质酸发酵的影响 1．氮源种类的确定 种子培养基中不同氮源对种子液中细胞生长及摇瓶发酵情况的影响见表 6-2-1。种子液中 细胞生长良好的，发酵培养时不一定能得到好的结果，表明细胞量多、但如果细胞合成透明 质酸的能力并未处于较佳的状态，最终不会得到较高的透明质酸产量。采用无机氮源(NH4)2SO4 作为种子培养基氮源，接入发酵培养基后透明质酸产量最低，可能是 NH4 +对菌体有着一定的 毒害作用，或者是培养基中缺少一定的生长因子，致使种子生长不好。采用复合有机氮源， 接入发酵培养基后其透明质酸产量好于单一的有机氮源，可能是因为不同有机氮源提供的不 同生长因子能够进行互补，利于细胞生长。在复合有机氮源中，牛肉膏和酵母粉各占氮源总 量 50%的种子培养基，接入发酵培养基后透明质酸产量最高；牛肉膏和蛋白胨各占氮源 50% 的其次；而蛋白胨和酵母粉各占氮源 50%的，接入发酵培养基后其发酵结果与采用单一有机 氮源的发酵结果几乎相同。 表 6-2-1 种子培养基中的不同氮源组成对透明质酸发酵结果的影响(1) 氮源(种子) BE (20gL -1 ) Pep (20gL -1 ) YE (20gL -1 ) BE(10gL -1 ) Pep(10gL -1 ) BE(10gL -1 ) YE(10gL -1 ) Pep(10gL -1 ) YE(10gL -1 ) (NH4)2SO4 (20gL -1 ) 种子 生物量 / gL -1 0.85 0.87 1.10 0.86 1.12 1.06 0.82 发酵 生物量 / gL -1 1.50 1.00 1.38 0.98 1.33 1.22 1.10 透明质酸 /gL -1 0.14 0.15 0.14 0.18 0.22 0.16 0.09 注∶BE，牛肉膏(beef extract)；Pep，蛋白胨(peptone)；YE，酵母粉(yeast extract) 在上述实验的基础上，进一步考察了 BHI 培养基和种子培养基中复合有机氮源的浓度对 透明质酸发酵的影响，结果见表 6-2-2。以 BHI 培养基作为种子培养基，接入发酵培养基后透 明质酸产量并不高。因此，种子培养基采用牛肉膏和酵母粉为复合氮源。由于牛肉膏和酵母 粉复合氮源内含有大量的生长因子，可以推测这种复合氮源能够提供血清或 BHI 所能提供的 生长因子，所以不加血清和 BHI 的种子同样可以使细胞较好地生长，使得种子培养基的成本 有所降低。 表 6-2-2 种子培养基中的不同氮源组成对透明质酸发酵结果的影响(2) 氮源 YE (5gL -1 ) Pep (5gL -1 ) YE (5gL -1 ) BE (5gL -1 ) Pep (5gL -1 ) BE (5gL -1 ) BHI 透明质酸 /gL -1 0.133 0.178 0.153 0.138 注∶BE，牛肉膏(beef extract)；Pep，蛋白胨(peptone)；YE，酵母粉(yeast extract) 2．氮源浓度的确定 考察由牛肉膏和酵母粉组成的复合氮源浓度对透明质酸发酵的影响，结果如表6-2-3所示。 随着氮源浓度的升高，种子液中细胞干重随之升高。当氮源浓度达 20 g/L 时，细胞干重也基 本稳定于最大值。此时透明质酸发酵也处于最佳状态。因此，在以后的研究中选用酵母粉和 牛肉膏为复合氮源，浓度各为 10 g/L。 表 6-2-3 种子培养基中氮源的不同浓度对发酵结果的影响

氮源浓度/gL1 生物量/gL 0.780.921.181.201.18 葡萄糖/ 15.711.85 8.2 透明质酸/gL1 0.160.220.260.240.23 透明质酸产率/gg10.00670.00770.00770.00710.0061 (二)种子培养基中碳源种类及浓度对透明质酸发酵的影响 碳源种类的确定 种子培养基中不同碳源对H23菌株发酵生产透明质酸的影响列于表62-4。采用葡萄糖为 种子培养基的碳源,接入发酵培养基后透明质酸产量最髙,其后依次是蔗糖和麦芽糖。而以 果糖、木糖、半乳糖为种子的碳源,效果较差。 表6-2-4种子培养基中的不同碳源组成对透明质酸发酵结果的影响 碳源种类 葡萄糖果糖蔗糖木糖半乳糖麦芽糖 透明质酸/gL10.220.120.200.110.150.19 2.葡萄糖浓度的确定 如表6-2-5所示,当葡萄糖的浓度为20gL时,种子液中细胞干重最高,但发酵后透明质 酸产量也最大。因此,采用葡萄糖为种子碳源,浓度为20gL。 表6-2-5种子培养基中不同葡萄糖浓度对发酵结果的影响 葡萄糖/gL 14 种子生物量/gL1 1.00 剩余葡萄糖/gL19.7 6.3 78 发酵透明质酸/gl 透明质酸产率/gg10.006300071 0.0069 0.0065 (三)种子培养基中金属离子及浓度对透明质酸发酵的影响 Mg2+的影响 对细胞来说,众多的金属离子当中,Mg2是最为重要的一种,它是许多酶活性中心不可 缺少的一部分。在EMP途径之中,磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化下形成烯醇式丙酮 酸和ATP,是EMP途径的一个限速步骤,而Mg2+对于丙酮酸激酶来说是必不可少的。由于 链球菌缺乏一个完整的TCA循环,它的能量主要来自EMP途径,因此需要提供适量的Mg2, 保证H23菌株胞内EMP途径的酶高效运转,使菌体生长良好 表6-2-6MgSO47H2O浓度对发酵的影响 MgSO 7H2O/g L 1.0 2.0 种子 生物量/gLl 1.13 1.21 1.15 剩余葡萄糖/gL11.08 0.62 0.87 发酵 透明质酸/gL 透明质酸产率/ggl0.00740.00750.00830.0076 如表6-2-6所示,随着MgSO47HO添加量的增大,种子液中细胞干重逐渐增大,当 MgSO4ⅦH2O为2.0g/L时,种子液中细胞干重达到最大值,产透明质酸性能也最佳。 2.Mn2浓度的确定 与Mg2+作用相类似,Mm2也是一部分酶活性部位的组成成分。如表6-2-7所示

9 氮源浓度 / gL -1 10 15 20 25 30 生物量 / gL -1 0.78 0.92 1.18 1.20 1.18 葡萄糖 / gL -1 15.7 11.8 5.5 6.2 8.2 透明质酸 / gL -1 0.16 0.22 0.26 0.24 0.23 透明质酸产率 / gg -1 0.0067 0.0077 0.0077 0.0071 0.0061 (二)种子培养基中碳源种类及浓度对透明质酸发酵的影响 1．碳源种类的确定 种子培养基中不同碳源对 H23 菌株发酵生产透明质酸的影响列于表 6-2-4。采用葡萄糖为 种子培养基的碳源，接入发酵培养基后透明质酸产量最高，其后依次是蔗糖和麦芽糖。而以 果糖、木糖、半乳糖为种子的碳源，效果较差。 表6-2-4 种子培养基中的不同碳源组成对透明质酸发酵结果的影响 碳源种类 葡萄糖 果糖 蔗糖 木糖 半乳糖 麦芽糖 透明质酸 / gL -1 0.22 0.12 0.20 0.11 0.15 0.19 2．葡萄糖浓度的确定 如表 6-2-5 所示，当葡萄糖的浓度为 20 g/L 时，种子液中细胞干重最高，但发酵后透明质 酸产量也最大。因此，采用葡萄糖为种子碳源，浓度为 20 g/L。 表 6-2-5 种子培养基中不同葡萄糖浓度对发酵结果的影响 葡萄糖 / gL -1 14 20 28 35 种子 生物量 / gL -1 1.00 1.25 1.02 1.15 发酵 剩余葡萄糖 / gL -1 9.7 6.3 7.8 12.8 透明质酸 / gL -1 0.19 0.24 0.22 0.18 透明质酸产率 / gg -1 0.0063 0.0071 0.0069 0.0065 (三)种子培养基中金属离子及浓度对透明质酸发酵的影响 1．Mg2+的影响 对细胞来说，众多的金属离子当中，Mg2+是最为重要的一种，它是许多酶活性中心不可 缺少的一部分。在 EMP 途径之中，磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化下形成烯醇式丙酮 酸和 ATP，是 EMP 途径的一个限速步骤，而 Mg2+对于丙酮酸激酶来说是必不可少的。由于 链球菌缺乏一个完整的 TCA 循环，它的能量主要来自 EMP 途径，因此需要提供适量的 Mg2+， 保证 H23 菌株胞内 EMP 途径的酶高效运转，使菌体生长良好。 表 6-2-6 MgSO47H2O 浓度对发酵的影响 MgSO47H2O /gL -1 1.0 1.5 2.0 2.5 种子 生物量 /gL -1 1.02 1.13 1.21 1.15 发酵 剩余葡萄糖 /gL -1 1.08 0.75 0.62 0.87 透明质酸 /gL -1 0.22 0.24 0.28 0.24 透明质酸产率 /gg -1 0.0074 0.0075 0.0083 0.0076 如表 6-2-6 所示，随着 MgSO47H2O 添加量的增大，种子液中细胞干重逐渐增大，当 MgSO47H2O 为 2.0 g/L 时，种子液中细胞干重达到最大值，产透明质酸性能也最佳。 2．Mn2+浓度的确定 与 Mg2+作用相类似，Mn2+也是一部分酶活性部位的组成成分。如表 6-2-7 所示

MnSO·4HO的浓度为0.10g/L时,种子液中细胞干重最大,增大浓度,细胞干重下降,说明 过高的MnSO44H2O浓度会抑制菌体生长。进行发酵试验,发现MnSO4HQO浓度为0.1g/L 的种子,其发酵生产性能也达到最佳状态,透明质酸的产量及产率系数也均为最高,无论增 加或是降低MnSO44H2O的浓度,发酵结果均有较大的下降 表6-2-7种子中MnSO44H2O浓度对发酵的影响 InSO4 4H2O/g L 0.10 Seed 生物量/gL1 0.9181.1310.8540.8490.790 葡萄糖/gL11.080.75093 发酵 透明质酸/gL10.1850.2710.2400.2030.162 透明质酸产率/gg0.00630.00830.00780.007200064 三、种子生长过程曲线和种龄的确定 种子质量的优劣不仅与培养基组成有关,还与种子的生理性状有关。当传代菌种接入种 子瓶(罐)中,要经过延滞期,对数生长期,静止期和死亡期。种龄太低的种子接入发酵罐中, 往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟,甚至造成异常发 酵:种龄过长则会引起菌体过早自溶,导致产物生产能力下降。通常,种龄以菌体处于生命 力极为旺盛的对数生长期后期,且培养液中细胞干重还未达到最高峰时较为合适,这样既可 保持高的细胞活力,又可获得尽可能多的细胞干重 图621为Sz00 epidemicus H23在种子培养基的生长过程曲线。从图中可以看出,菌种 接入种子培养基3~4h后进入对数生长期,18h左右细胞干重达到最高峰,在此之后,细胞 干重开始下降。因此选择接种种龄为15~16h 05101520230 t/h 图6-2-1透明质酸生产菌株H23的种子生长曲线 四、发酵培养基组成对透明质酸发酵的影响 (一)不同氮源对透明质酸发酵的影响 如表6-2-8所示,当发酵培养基的氮源采用酵母粉时,菌体生长最好,透明质酸产量也最 高,接近03g/。酵母粉和蛋白胨的混合氮源及玉米浆居其次,其余均很低。不加氮源仅利用 种子中带入的氮源也可生长一定量菌体和合成一定的透明质酸。而采用无机氮源(NH4)SO时, 透明质酸产量和细胞干重都是实验组中最低的,说明(NH4)sO4对菌体的代谢有抑制。表6-28 还表明采用不同氮源时,细胞干重高,透明质酸产量也高。很多链球菌对营养要求比较高, 而酵母粉中还含有大量的生长因子,这也是 Streptococcus zooepidemicus H23以酵母粉为氮源时

10 MnSO44H2O 的浓度为 0.10 g/L 时，种子液中细胞干重最大，增大浓度，细胞干重下降，说明 过高的 MnSO44H2O 浓度会抑制菌体生长。进行发酵试验，发现 MnSO44H2O 浓度为 0.1 g/L 的种子，其发酵生产性能也达到最佳状态，透明质酸的产量及产率系数也均为最高，无论增 加或是降低 MnSO44H2O 的浓度，发酵结果均有较大的下降。 表 6-2-7 种子中 MnSO44H2O 浓度对发酵的影响 MnSO44H2O /gL -1 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Seed 生物量 /gL -1 0.918 1.131 0.854 0.849 0.790 发酵 葡萄糖 /gL -1 1.08 0.75 0.93 1.17 1.45 透明质酸 /gL -1 0.185 0.271 0.240 0.203 0.162 透明质酸产率 /gg -1 0.0063 0.0083 0.0078 0.0072 0.0064 三、种子生长过程曲线和种龄的确定 种子质量的优劣不仅与培养基组成有关，还与种子的生理性状有关。当传代菌种接入种 子瓶(罐)中，要经过延滞期，对数生长期，静止期和死亡期。种龄太低的种子接入发酵罐中， 往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至造成异常发 酵；种龄过长则会引起菌体过早自溶，导致产物生产能力下降。通常，种龄以菌体处于生命 力极为旺盛的对数生长期后期，且培养液中细胞干重还未达到最高峰时较为合适，这样既可 保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞干重。 图 6-2-1 为 S. zooepidemicus H23 在种子培养基的生长过程曲线。从图中可以看出，菌种 接入种子培养基 3～4 h 后进入对数生长期，18 h 左右细胞干重达到最高峰，在此之后，细胞 干重开始下降。因此选择接种种龄为 15~16 h。 生物量 /gL-1 t /h 图 6-2-1 透明质酸生产菌株 H23 的种子生长曲线 四、发酵培养基组成对透明质酸发酵的影响 (一)不同氮源对透明质酸发酵的影响 如表6-2-8所示，当发酵培养基的氮源采用酵母粉时，菌体生长最好，透明质酸产量也最 高，接近0.3 g/L。酵母粉和蛋白胨的混合氮源及玉米浆居其次，其余均很低。不加氮源仅利用 种子中带入的氮源也可生长一定量菌体和合成一定的透明质酸。而采用无机氮源(NH4)2SO4时， 透明质酸产量和细胞干重都是实验组中最低的，说明(NH4)2SO4对菌体的代谢有抑制。表6-2-8 还表明采用不同氮源时，细胞干重高，透明质酸产量也高。很多链球菌对营养要求比较高， 而酵母粉中还含有大量的生长因子，这也是Streptococcus zooepidemicus H23以酵母粉为氮源时