第十三章DNA的复修复 生物体的遗传信息储存在DNA中,并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息 自DNA转录给RNA,然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能,使后代表现出与亲代相似的遗传性状。 1958年, CRick提出中心法则: (1)以原DNA分子为模板,合成出相同DNA分子的过程。 (2)以某一段DNA分子为模板,合成出与其序列对应的RNA分子的过程 (3)以mRNA为模板,根据一联密码规则,合成对应蛋白质的过程。 中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。 图 DNA生物合成有两种方式:DNA复制和反转录 DNA体内复制涉及:原核、真核生物的染色体、细菌质粒(环状,双链)、真核细胞器DNA(线粒体 叶绿体)、病毒(双链,环状) DNA的体外复制:分子克隆。 DNA的复制 DNA半保留复制 1953年, Watson和〔ik在提出DNA双螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复 P321图191wdon和〔ick提出的DNA双螺旋复制模型 在复制过程中,首先亲代双链解开,然后每条链作为模板,在其上合成互补的子代链,结果新形成的两 个子代DNA与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样,而且每个子代DNA分子中有一条链完全来自亲代DNA 另一条是新合成的。 1958年, Meselson和Sah用N标记 E coli dNA,证明了DNA的复制是半保留复制。 P322图192DNA的半保留复制 1963年, Cairns用放射自显影法,在显微镜下首次观察到完整的正在复制的 E coli染色体DNA。 P323图19-3 H-脱氧胸苷标记 Ecoli dNA,经过将近两代时间,用溶菌酶消化细胞壁,将 Ecoli.DNA转至膜上, 干燥,压感光胶片,狃放出β粒子,还原银,在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体DNA 是一个环状分子,并以半保留的形式进行复制。 DNA的半保留复制冋以说明DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制,DNA的多核苷酸链仍可以保持 完整,并存在于后代而不被分解掉
１ 第十三章 DNA的复制和修复 生物体的遗传信息储存在 DNA中，并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息 自 DNA转录给RNA，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。 1958 年，F.Crick 提出中心法则： （1）以原DNA 分子为模板，合成出相同DNA 分子的过程。 （2）以某一段DNA 分子为模板，合成出与其序列对应的RNA分子的过程。 （3）以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。 中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。 图 DNA 生物合成有两种方式：DNA 复制和反转录 DNA体内复制涉及：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、 叶绿体）、病毒（双链，环状） DNA 的体外复制：分子克隆。 第一节 DNA的复制 一、 DNA 半保留复制 1953 年，Watson 和 Crick 在提出 DNA双螺旋结构模型时就推测 DNA可能按照半保留机制进行自我复 制。 P321 图 191 Watson 和Crick 提出的DNA双螺旋复制模型 在复制过程中，首先亲代双链解开，然后每条链作为模板，在其上合成互补的子代链，结果新形成的两 个子代DNA与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样，而且每个子代DNA分子中有一条链完全来自亲代DNA， 另一条是新合成的。 1958 年，Meselson 和 Stahl用15N 标记E.coli.DNA，证明了DNA的复制是半保留复制。 P322 图 19-2 DNA 的半保留复制。 1963 年，Cairns 用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的E. coli. 染色体DNA。 P323 图 19-3 3H-脱氧胸苷标记 E.coli. DNA ，经过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将 E.coli. DNA 转至膜上， 干燥，压感光胶片，3H放出β粒子，还原银，在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体DNA 是一个环状分子，并以半保留的形式进行复制。 DNA 的半保留复制可以说明 DNA 在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA 的多核苷酸链仍可以保持 完整，并存在于后代而不被分解掉
复制起点、单位和方向 DNA的复制是在起始阶段进行控制的,一旦复袆起始,它就会继续下去直到整个复制子完成复制。 1、复制起点 复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时,两条链的复制起点并不总是在同一点上 (如D环复制)。 在一个完整的细胞周期中,每一个复制起点只使用一次,完成一次复制过程。 多数生物的复制起点,都是DNA呼吸作用强烈(甲醛变性实验)的区段,即经常开放的区段,富含AT ★环状DNA复制起点的确定方法 P325图196 ★复制起点的克隆和功能分析—一重组质粒转化法 大肠杆菌的复制起点oiC区IKb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样,受到严密控制,每 个细胞只有12个拷贝,用核酸外切酶缩短onC克隆片段的大小,最后得到245bp的基本功能区,携带它的 质粒依然能够自我复制,拷贝数可以增加到20以上,这说明发动复制的序列在245bp的基本功能区,而决定 拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间。 鼠伤寒沙门氏菌的起点位于段296bp的DNA片段上,与大肠杆菌的复制起始区有86%同源性,而且 有些亲缘关系较远的细菌,其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此,复制起始区的结构可能是很保守的。 起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。 2、复制单位 复制子( Replicon): Genome能独立进行复制的单位,每个复制子都含有一个复制点 原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子,它们都是单复制子,都在一个 固定的起点开始复制,复制方向大多数是双向的,少数是单向复制。多数是对称复制,少数是不对称复制( 条链复制后才进行另一条链的复制) 环状DNA的复制眼象θ,称θ形复制。 真核生物的染色体DNA是线形双链分子,含有许多复制起点,因此是多复制子,每个复制子约有 100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子 病毒DNA多种多样,环状或线形,双链或单链,但都是单复制子。 3、复制方向 定点起始,复制方向大多数是双向的(等速进行或异速进行),形成两个复制叉,少数是单向复制,形成 个复制叉。 ★用射自景验判断DNA的复制方向及速度 低方姓性科-膀胸苷 高姓性和H臃胸苷
２ 二、 复制起点、单位和方向 DNA 的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。 1、 复制起点 复制起点是以一条链为模板起始 DNA 合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上 （如 D 环复制）。 在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。 多数生物的复制起点，都是 DNA 呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含 A.T。 ★环状 DNA复制起点的确定方法 P325 图 19-6 ★复制起点的克隆和功能分析——重组质粒转化法 大肠杆菌的复制起点 oriC 区 1Kb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每 个细胞只有 1-2 个拷贝，用核酸外切酶缩短 oriC 克隆片段的大小，最后得到 245bp 的基本功能区，携带它的 质粒依然能够自我复制，拷贝数可以增加到 20 以上，这说明发动复制的序列在 245bp 的基本功能区，而决定 拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb 之间。 鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段 296bp 的 DNA片段上，与大肠杆菌的复制起始区有 86%同源性，而且 有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。 起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。 2、 复制单位 复制子(Replicon)：Genome 能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。 原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器 DNA 都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个 固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一 条链复制后才进行另一条链的复制）。 环状 DNA 的复制眼象θ，称θ形复制。 真核生物的染色体 DNA 是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有 100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000 个复制子。 病毒 DNA 多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。 3、 复制方向 定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成 一个复制叉。 ★用放射自显影实验判断DNA 的复制方向及速度 低放射性 3H-脱氧胸苷 高放射性 3H-脱氧胸苷
a.单向 b.双向等速 三种结果图形 C.双向异速 Eco的个温度敏株,在42C时,能吏DNA在成复袆后,不始新的复制过程,而在25°℃时 复制攻又能能恢复。 4、DNA的几种复制方式 (1)、直线双向复制 单点,双向,T7 多点,双向,真核染色体DNA (2)、θ型复制:环状双链DNA,单向或双向CE.coli.) (3)、滚环复制:环状犬单链DN,Φx174 (4)、D环复制:线粒体、叶绿体DN 5)、多复制叉复制 第一轮复制尚未完成,复制起点就开始第二轮的复制。 在Eco富营时,司采眵多复袆叉复制式 Ecoli. dna的复袆最快可50Kb/min,完全复袆需 omin,富营时,20min分裂。而真染色僳要68小时。 与DNA复制有关的酶及蛋白质因子 目前已发现30多利酶及蛋白质因子参与DNA复制 DNA的聚合反应和聚合 DNA生物合成5→3,化学合成3→5 l、DNA聚合反应必备的条件 (1)DNA聚合酶 (2)DNA模板(反转录时用RNA模板) (3)引物(DNA、RNA或蛋白质) (4)4种dNIP
３ a. 单向 b. 双向等速 三种结果图形 c. 双向异速 E.coli.的一个温度敏感株，在 42℃时，能使 DNA 在完成复制后，不再开始新的复制过程，而在 25℃时 复制功又能能恢复。 4、 DNA 的几种复制方式 （1）、 直线双向复制 单点，双向，T7 多点，双向，真核染色体DNA （2）、 θ型复制：环状双链 DNA，单向或双向（E .coli.） （3）、 滚环复制：环状单链 DNA，Φx174 （4）、 D 环复制：线粒体、叶绿体 DNA （5）、 多复制叉复制： 第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。 在 E.coli.富营养时，可采取多复制叉复制方式。E.coli. DNA 的复制最快可达 50Kb/min，完全复制需 40min，富营养时，20min 分裂。而真核染色体要6-8小时。 三、 与 DNA复制有关的酶及蛋白质因子 目前已发现30 多种酶及蛋白质因子参与DNA复制 （一） DNA的聚合反应和聚合酶 DNA 生物合成 5 ，→3 ，，化学合成3 ，→5 ， 1、 DNA 聚合反应必备的条件 ⑴ DNA 聚合酶 ⑵ DNA 模板(反转录时用RNA模板) ⑶引物 (DNA、RNA或蛋白质) ⑷ 4 种 dNTP
(5)Mg2+ 2、聚合反应过程及特点 总反应式: nIdATP DNA poL n2dGTP +DNA dGMP DNA+(n1+n2+n3+n4) Ppi n3dCTP nadTTP d TMP P329图19-10 P330图191 在链的延长过程中,链的游离3-羟基,对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击,生成3.5 磷酸二酯键,并脱下焦磷酸。 DNA聚合酶的反应特点 (1)以4种dNIP为底物 (2)反应需要接受模板的指导,不能催化游离的dNIP的聚合 (3)反应需有引物3羟基存在 (4)链生长方向5→3 (5)产物DNA的性质与模板相同 由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型 P331图1912 (1)发荚环结构ε加入单链DNA作为模板和引物,3羟基端回折成引物链。 (2)末端延伸聚合:加入双链DNA作为模板和引物,3’末端突出作为模板。 (3)分枝型和切口平移型聚合:加入双链DNA,聚合发生在切口或末端单链区。 (4)环形聚合:加入带引物的环形DNA作为模板。 4、E. coli dNA聚合酶 (1) E coli. DNA pol I (Kornberg A, 400 copy/cell) 单体酶,分子量10Kd,含一个Zm2,每个细胞中含400个 DNA pol.I 催化活性: 5→3′聚合活性 3→5外切活性 5→3外切活性 用蛋白水解酶将 DNApol.I部分水解可得: 大片段( Klenow),75Kd,活性:5→3聚合活性、3→5′外切活性。 小片段,36Kd,活性:5→3^外切活性(只作用于双链DNA的碱基配对部分,切除修复) Klenow片段的用途: a补齐DNA3隐缩未端
４ ⑸ Mg 2+ 2、 聚合反应过程及特点 总反应式： n1dATP DNA pol . dAMP n2dGTP +DNA dGMP DNA+（n1+n2+n3+n4）PPi n3dCTP Mg2+ dCMP n4dTTP dTMP P329 图 19-10 P330 图19-11 在链的延长过程中，链的游离 3 ， -羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击，生成 3 ， .5， -磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。 DNA 聚合酶的反应特点： ⑴ 以 4 种 dNTP 为底物 ⑵ 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP 的聚合。 ⑶ 反应需有引物3 ， -羟基存在 ⑷ 链生长方向5 ， → 3 ， ⑸ 产物 DNA的性质与模板相同 3、 由 DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型 P331 图19-12 （1） 发荚环结构：加入单链DNA作为模板和引物，3 ＇羟基端回折成引物链。 （2） 末端延伸聚合：加入双链DNA 作为模板和引物，3’末端突出作为模板。 （3） 分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在切口或末端单链区。 （4） 环形聚合：加入带引物的环形DNA 作为模板。 4、 E.coli DNA聚合酶 （1）、 E.coli. DNA pol.I（Kornberg 酶，400 copy/cell） 单体酶，分子量109Kd，含一个Zn 2+，每个细胞中含400 个DNA pol.Ⅰ 催化活性： 5 ， → 3 ， 聚合活性 3 ， → 5 ， 外切活性 5 ， → 3 ， 外切活性 用蛋白水解酶将DNA pol.Ⅰ部分水解可得： 大片段（Klenow），75Kd，活性：5 ， → 3 ，聚合活性、3 ， → 5 ，外切活性。 小片段，36Kd，活性：5 ， → 3 ，外切活性（只作用于双链DNA 的碱基配对部分，切除修复）。 Klenow 片段的用途： a 补齐 DNA 3，隐缩未端
b.标记DNA片段未端 c.cDNA合成第二链 d.dDNA测序 (2)、E.coli. DNA Pol.Ⅱ(100copy/cell) 单体酶,分子量120Kd 催化活性:5→3聚合(活性很低 外切 可能在DNA的修复中起某中作用。 (3)、E. coli DNA polⅢ(复制酶,1020copy/eell) 寡聚酶,全酶由10种共22个亚基组成,a、ε和0三种亚基组成核心酶 P334表10-3 DNA pol.是合成新链DNA主要的酶,又称复制續 Replicase) PolⅢ的5→3外切酶活性只作用于单链DNA P334表192Ecoi三种DNA聚合酶的性质比较 ★DNA聚合酶有6个结合位点 (1)模板DNA结合位点 (2)引物结合位点 3)引物3OH位点、反应位点 (4)底物dNTP结合位点 (5)5→3外切位点(po没有) (6)3→5外切位点校正 5、真核生物DNA聚合酶 P334表194真核生物DNA聚合酶 真核DNA聚合酶般不具备外切活力,可能由另外的酶在DNA复制中起校正功能。 (1)DNA聚合酶α,多亚基,功能与 E coli. pol类似,是真核DNA复制酶。 (2)DNA聚合酶β,主要在DNA损伤的修复中起作用 (3)DNA聚合酶γ,从线粒体得到,可能与线粒体DNA的复制有关 (4)DNA聚合酶δ,特点:有3→5外切活力。 引物酶或RNA聚合酶(引发酶) 细胞内,DNA的复制需要引物(DNA或RNA),引物酶或RNA聚合酶可合成6-10个碱基的RNA引
５ b. 标记 DNA片段未端 c．cDNA合成第二链 d．d DNA测序 （2）、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ（100 copy/cell） 单体酶，分子量120Kd 催化活性：5 ，→ 3 ，聚合(活性很低) 3 ，→ 5 ，外切 可能在 DNA的修复中起某中作用。 （3）、 E.coli.DNA pol.Ⅲ（复制酶，10-20 copy/cell） 寡聚酶，全酶由10 种共22 个亚基组成，α、ε和θ三种亚基组成核心酶。 P334 表 10-3 DNA pol.Ⅲ是合成新链DNA 主要的酶，又称复制酶(Replicase) Pol.Ⅲ的5 ，→3 ，外切酶活性只作用于单链DNA。 P334 表 19-2 E.coli 三种DNA 聚合酶的性质比较 ★DNA聚合酶有6 个结合位点 ⑴ 模板 DNA 结合位点 ⑵ 引物结合位点 ⑶ 引物 3 ， -OH位点、反应位点 ⑷ 底物 dNTP 结合位点 ⑸ 5 ， → 3 ， 外切位点(pol.Ⅱ没有) ⑹ 3 ， → 5 ， 外切位点(校正) 5、 真核生物DNA聚合酶 P334 表 19-4 真核生物 DNA 聚合酶 真核 DNA 聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在DNA复制中起校正功能。 ⑴ DNA 聚合酶α，多亚基，功能与E.coli. pol.Ⅲ类似，是真核DNA 复制酶。 ⑵ DNA 聚合酶β，主要在DNA损伤的修复中起作用。 ⑶ DNA 聚合酶γ，从线粒体得到，可能与线粒体DNA 的复制有关。 ⑷ DNA 聚合酶δ，特点：有3 ， → 5 ，外切活力。 （二） 引物酶或RNA聚合酶（引发酶） 细胞内，DNA的复制需要引物（DNA 或 RNA），引物酶或 RNA 聚合酶可合成 6-10 个碱基的 RNA 引