第十四章RNA的生物合成 RNA的生物合成包括转录和RNA的复制。 转录( transcription):以一段DNA的遗传信息为模板,在RNA聚合酶作用下,合成出对应的RNA的过 程,或在DNA指导下合成RNA。 转录产物:mRNA、rRNA、tRNA、小RNA 除某些病毒基因组RNA外,绝大多数RNA分子都来自DNA转录的产物。 转录研究的主要问题 ①RNA聚合酶②转录过程③转录后加工④转录的调控 ①③是基本内容,④是目前研究的焦点,转录调控是基因调控的核心。 转录与DNA复制的异同: 相同:要有模板,新链延伸方向5→3,碱基的加入严格遵循碱基配对原则。 相异:①复制需要引物,转录不需引物。 ②转录时,模板DNA的信息全保留,复制时模板信息是半保留。 ③转录时,RNA聚合酶只有5→3聚合作用,无5→3及3→5外切活性。 转录是基因表达的第一步,也是最关键的一步。 基因表达的终产物:①RNA②蛋白质 转录过程涉及两个方面 ①RNA合成的酶学过程 ②RNA合成的起始信号和终止信号,即DNA分子上的特定序列 DNA正链:与mRNA序列相同的DNA链 负链:与正链互补的DNA链 转录单位的起点核苷酸为+1,起点右边为下游(转录区,转录起点左侧为上游,用负数表示:-1,-2, 第一节 DNA指导的RNA合成(转录 RNA链的转录,起始于DNA模板的一个特定位点,并在另一位点终止,此转录区域称为一个转录单位 个转录单位可以是一个基因(真核),也可以是多个基因(原核) 基因的转录是有选择性的,细胞不同生长发育阶段和细胞不境条件的改变,将转录不同的基因。 转录的起始由DNA上的启动子区控制,转录的终止由DNA上的终止子控制,转录是通过DNA指导的 RNA聚合酶来实现的。 丶、RNA聚合酶 RNA合成的基本特征 ①底物:NTP(ATP、GIP、CIP、UTP) ②RNA链生长方向:5→3 ③不需引物
１ 第十四章 RNA的生物合成 RNA 的生物合成包括转录和 RNA 的复制。 转录（transcription）：以一段DNA的遗传信息为模板，在 RNA 聚合酶作用下，合成出对应的RNA的过 程，或在 DNA 指导下合成 RNA。 转录产物：mRNA 、rRNA、 tRNA、小RNA 除某些病毒基因组RNA 外，绝大多数RNA分子都来自DNA转录的产物。 转录研究的主要问题 ①RNA 聚合酶 ②转录过程 ③转录后加工 ④转录的调控 ①~③是基本内容，④是目前研究的焦点，转录调控是基因调控的核心。 转录与 DNA复制的异同： 相同：要有模板，新链延伸方向5’→3’，碱基的加入严格遵循碱基配对原则。 相异：①复制需要引物，转录不需引物。 ②转录时，模板DNA的信息全保留，复制时模板信息是半保留。 ③转录时，RNA聚合酶只有5’→3’聚合作用，无 5’→3’及 3’→5’外切活性。 转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。 基因表达的终产物：①RNA ②蛋白质 转录过程涉及两个方面 ①RNA 合成的酶学过程 ②RNA 合成的起始信号和终止信号，即DNA分子上的特定序列。 DNA 正链：与 mRNA序列相同的DNA链。 负链：与正链互补的DNA链。 转录单位的起点核苷酸为+1，起点右边为下游（转录区），转录起点左侧为上游，用负数表示：-1，-2， -3。 第一节 DNA指导的RNA合成（转录） RNA 链的转录，起始于 DNA 模板的一个特定位点，并在另一位点终止，此转录区域称为一个转录单位。 一个转录单位可以是一个基因（真核），也可以是多个基因（原核）。 基因的转录是有选择性的，细胞不同生长发育阶段和细胞环境条件的改变，将转录不同的基因。 转录的起始由DNA上的启动子区控制，转录的终止由 DNA上的终止子控制，转录是通过 DNA 指导的 RNA 聚合酶来实现的。 一、 RNA 聚合酶 RNA 合成的基本特征 ①底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP） ②RNA 链生长方向：5’→3’ ③不需引物
④需DNA模板 反应 勹4TP+n2GTP+nCTP+n2UmP、RNA聚合酶/DN4模板、Mg~→RNA+(n1+n2+n3+n4)PP l、E. ColINA聚合酶(原核 Ecol和其它原核细胞一样,只有一种RNA聚合酶,合成各种RNA(mRNA、tRNA、rRNA) 一个 Ecoli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子,在任时刻,大部分聚合酶(5000左右)正在参与 RNA的合成,具体数量依生长条件而定。 E colirNa聚合酶全酶( holoenzyme)分子量46万Da,由六个亚基组成,a2BBω,另有两个Zm?2 无σ亚基的酶叫核心酶,核心酶只能使已开始合成的RNA链延长,而不具备起始合成活性,加入σ亚 基后,全酶才具有起始合成RNA的能力,因此,σ亚基称为起始因子 ECOlI RNA聚合酶各亚基的大小与功能: 亚基 基数分子量基因 功能 (KD) Bβ0 160 IDOC 与模板DNA结合 rpoB 与核苷酸结合,起始和催化部位 70 rpoD 起始识别因子 37 rpoA 与DNA上启动子结合 不详 不同的细菌,B、β、a亚基分子量变化不大,σ亚基分子量变化较大,44KD9KD。 σ亚基的功能:核心酶在DNA上滑动,σ亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数,增加停留时间,使 聚合酶迅速找到启动子并与之结合,亚基本身无催化活性 不同的o因子识别不同的启动子,从而表达不同的基因。 不同的原核生物,都具有相同的核心酶,但σ亚基有所差别,这决定了原核基因表达的选择性。 RNA聚合酶的催化活性:RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板,转录时DNA的双链结构部分解开, 转录后DNA仍然保持双链的结构。 P360图20-1RNA聚合酶的活性中心 核心酶覆盖60b的DNA区域,其中解链部分17bp左右, RNA-DNA杂合链约12bp 纯的RNA聚合酶,在离体条件下可转录双链DNA,但在体内,DNA的两条链中只有一条可用于转录, 这可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失了o亚基引起的 解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内在特性,在酶的前端解螺旋,在后端以相反方向重新螺旋化
２ ④需 DNA 模板 反应： 1、 E.coli RNA聚合酶（原核） E.coli和其它原核细胞一样，只有一种RNA聚合酶，合成各种RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。 一个 E.coli 细胞中约有 7000 个 RNA 聚合酶分子，在任一时刻，大部分聚合酶（5000 左右）正在参与 RNA 的合成，具体数量依生长条件而定。 E.coliRNA 聚合酶全酶（| holoenzyme）分子量 46万 Da，由六个亚基组成，α2ββ’ σω，另有两个 Zn2+。 无σ亚基的酶叫核心酶，核心酶只能使已开始合成的 RNA 链延长，而不具备起始合成活性，加入σ亚 基后，全酶才具有起始合成RNA 的能力，因此，σ亚基称为起始因子。 E.coli RNA聚合酶各亚基的大小与功能： 亚基 亚基数 分 子 量 （KD） 基因 功能 β’ 1 160 rpoC 与模板 DNA结合 β 1 150 rpoB 与核苷酸结合，起始和催化部位。 σ 1 70 rpoD 起始识别因子 α 2 37 rpoA 与 DNA上启动子结合 ω 1 9 ---- 不详 不同的细菌，β’、β、α亚基分子量变化不大，σ亚基分子量变化较大，44KD~92KD。 σ亚基的功能：核心酶在 DNA 上滑动，σ亚基能增加酶与 DNA启动子的结合常数，增加停留时间，使 聚合酶迅速找到启动子并与之结合，σ亚基本身无催化活性。 不同的σ因子识别不同的启动子，从而表达不同的基因。 不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但σ亚基有所差别，这决定了原核基因表达的选择性。 RNA 聚合酶的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开， 转录后 DNA仍然保持双链的结构。 P360 图 20-1RNA 聚合酶的活性中心 核心酶覆盖60bp 的DNA 区域，其中解链部分17bp 左右，RNA-DNA 杂合链约12bp。 纯的RNA聚合酶，在离体条件下可转录双链 DNA，但在体内，DNA的两条链中只有一条可用于转录， 这可能是由于 RNA 聚合酶在分离时丢失了σ亚基引起的。 解旋和重新螺旋化也是 RNA 聚合酶的内在特性，在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化， RNA n n n n PPi RNA DNA Mg n ATP n GTP n CTP n UTP ( 1 2 3 4) / 2 1 + 2 + 3 + 4 ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ ⎯→ + + + + 聚合酶 模板、 +
活体状况中,可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。 37℃时,RNA聚合酶的聚合速度可达40-100个核苷酸秒 2、真核生物RNA聚合酶 真核生物的转录机制要复杂得多,有三种细胞核内的RNA聚合酶:RNA聚合酶I转录RNA,RNA聚 合酶Ⅱ转录mRNA,RNA聚合酶Ⅲ转录tRNA和其它小分子RNA。这三种RNA聚合酶分子量都在50万 左右,亚基数分别为6-15。 P362表20-3真核生物RNA聚合酶的分类、分布及各自的功能 动物、植物、昆虫等不同来源的细胞, RNApolⅡ的活性都可被低浓度的α-鹅膏蕈碱抑制,而 RNApol Ⅰ不受抑制。 动物 RNApol受高浓度的α鹅膏蕈碱抑制,而酵母、昆虫的 RNApoll不受抑制。 除了细胞核RNA聚合酶外,还分离到践线粒体和叶绿体RNA聚合酶,它们的结构简单,能转录所有种类 的RNA,类似于细菌RNA聚合酶 3、噬菌体T3和Ⅳ7编码的RNA聚合酶 仅为一条分子量IKD的多肽链,这些聚合酶只需要识别噬菌体DNA的少数启动子,并无选择地与其 作用,37℃时的聚合速度200mt秒 、RNA聚合酶催化的转录过程(Eco) P361图202 1、起始 RNA聚合酶结合到DNA双链的特定部位,局部解开双螺旋,第一个核苷酸掺λ转录起始位点,从此开 始RNA链的延伸 在新合成的RNA链的5未端,通常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷(pG或ppA),即合成的第 个底物是GIP或ATP。 起始过程中,σ因子起关键作用,它能使聚合酶迅速地与DNA的启动子结合,σ亚基与β'结合时,β 亚基的构象有利于核心酶与启动子紧密结合,。 正链:与mRNA序列相同的两、链。 负链:模板链。 转录起点是+1,上游是-1 2、延长 转录起始后,σ亚基释放,离开核心酶,使核心酶的βˆ亚基构象变化,与DNA模板亲和力下降,在 DNA上移动速度加快,使RNA链不断延长 转录起始后,σ亚基便从全酶中解离出来,然后nsA亚基结合到核心酶上,由nsA亚基识别序列序列
３ 活体状况中，可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。 37℃时，RNA聚合酶的聚合速度可达40~100 个核苷酸/秒 2、 真核生物RNA聚合酶 真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA 聚合酶：RNA 聚合酶I 转录 rRNA，RNA 聚 合酶II 转录 mRNA，RNA聚合酶 III 转录tRNA和其它小分子 RNA。这三种 RNA 聚合酶分子量都在 50 万 左右，亚基数分别为6-15。 P362 表 20-3 真核生物RNA聚合酶的分类、分布及各自的功能 动物、植物、昆虫等不同来源的细胞，RNApolⅡ的活性都可被低浓度的α-鹅膏蕈碱抑制，而 RNApol Ⅰ不受抑制。 动物 RNApolⅢ受高浓度的α-鹅膏蕈碱抑制，而酵母、昆虫的 RNApolⅢ不受抑制。 除了细胞核 RNA 聚合酶外，还分离到线粒体和叶绿体 RNA聚合酶，它们的结构简单，能转录所有种类 的 RNA，类似于细菌RNA聚合酶。 3、 噬菌体 T3和 T7 编码的RNA聚合酶 仅为一条分子量 11KD 的多肽链，这些聚合酶只需要识别噬菌体 DNA 的少数启动子，并无选择地与其 作用，37℃时的聚合速度200nt/秒。 二、 RNA 聚合酶催化的转录过程（E.coli） P361 图 20-2 1、 起始 RNA 聚合酶结合到DNA双链的特定部位，局部解开双螺旋，第一个核苷酸掺入转录起始位点，从此开 始 RNA链的延伸。 在新合成的 RNA 链的 5’末端，通常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷（pppG 或 pppA），即合成的第一 个底物是 GTP 或ATP。 起始过程中，σ因子起关键作用，它能使聚合酶迅速地与DNA的启动子结合，σ亚基与β’结合时，β’ 亚基的构象有利于核心酶与启动子紧密结合，。 正链：与 mRNA序列相同的两、链。 负链：模板链。 转录起点是+1，上游是-1。 2、 延长 转录起始后，σ亚基释放，离开核心酶，使核心酶的β’亚基构象变化，与 DNA 模板亲和力下降，在 DNA 上移动速度加快，使RNA链不断延长。 转录起始后，σ亚基便从全酶中解离出来，然后 nusA亚基结合到核心酶上，由 nusA 亚基识别序列序列
3、终止 RNA聚合酶到达转录终止点时,在终止辅助因子的帮助下,聚合反应停止,RNA链和聚合酶脱离DNA 模板链,msA又被σ亚基所取代。 由此形成RNA聚合酶起始复合物与终止复合物两种形式的循环。 三、启动子和转录因子 启动子:RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的段DNA序列。 转录因子:RNA聚合酶在进行转录时,常需要一些辅助因子(蛋白质)参与作用,此类蛋白质统称为转 录因子。 足迹法和DNA测序法确定启动子的序列结构。 P363 原核启动子结构与功能 分析比较上百种启动子序列,发现不同的启动子都存在保守的共同序列,包括RNA聚合酶识别位点和 结合位点。 (1)、-10序列 (Pribnow框 在转录起点上游大约-10处,有一个6bp的保守序列 TATAAT,称 Pribnow框。此段序列出现在4到-13bp 之间,每个位点的保守性在459-100% 频度:T89ATsA6 sA6 TI0o 据预测, Pribnow框中,一开始的TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酎时起十分重要的作用 目前认为, Pribnow框决定转录方向。酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物, Pribnow框中DNA 序列在转录方向上解开,形成开放型起始结构,它是RNA聚合酶牢固的结合位点,是启动子的关键部位。 RNA聚合酶的结合,诱导富含AT的 Erenow框的双链解开,然后进·步扩大成17个核苷酸长度的泡 状物,在泡状物中RNA聚合酶从模板链开始转录RNA产物。 (2)、-35序列( Sexfama box)(识别区域) 只含-10序列的DNA不能转录,在10序列上游还有一个保守序列,其中心约在35位置,称为35序列, 此序列为RNA酶的识别区域 各碱基出现频率如下:T85T8G8A61C6As,其中TTG十分保守。 35序列的功能:它是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点。因此,-35序列对RNA聚合酶 全酶有很高的亲和性。-35序列的核苷酸结构,在很大程度上决定了启动子的强度,RNA聚合酶易识别强的 启动子。 35序列提供RNA聚合酶识别信号, -10序列有助于DNA局部双链解开, 启动子结构的不对称性决定了转录的方向。 P364图204原核型启动子的结构
４ 3、 终止 RNA 聚合酶到达转录终止点时，在终止辅助因子的帮助下，聚合反应停止，RNA 链和聚合酶脱离 DNA 模板链，nusA 又被σ亚基所取代。。 由此形成 RNA 聚合酶起始复合物与终止复合物两种形式的循环。 三、 启动子和转录因子 启动子：RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA 序列。 转录因子：RNA 聚合酶在进行转录时，常需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，此类蛋白质统称为转 录因子。 足迹法和 DNA 测序法确定启动子的序列结构。 P363 （一） 原核启动子结构与功能 分析比较上百种启动子序列，发现不同的启动子都存在保守的共同序列，包括 RNA 聚合酶识别位点和 结合位点。 （1）、 -10 序列（Pribnow 框） 在转录起点上游大约-10 处，有一个 6bp 的保守序列 TATAAT，称 Pribnow 框。此段序列出现在-4 到-13bp 之间，每个位点的保守性在45%-100%。 频度： T89 A89T50A65A65 T100 据预测，Pribnow框中，一开始的TA 和第6 位最保守的T在结合RNA 聚合酶时起十分重要的作用。 目前认为，Pribnow 框决定转录方向。酶在此部位与 DNA 结合形成稳定的复合物，Pribnow 框中 DNA 序列在转录方向上解开，形成开放型起始结构，它是RNA 聚合酶牢固的结合位点，是启动子的关键部位。 RNA 聚合酶的结合，诱导富含 AT 的 Pribnow 框的双链解开，然后进一步扩大成 17 个核苷酸长度的泡 状物，在泡状物中RNA 聚合酶从模板链开始转录RNA 产物。 （2）、 -35 序列（Sexfama box）（识别区域） 只含-10 序列的DNA不能转录，在-10 序列上游还有一个保守序列，其中心约在-35 位置，称为-35 序列， 此序列为 RNA 酶的识别区域。 各碱基出现频率如下：T85 T83 G81A61C69A52 ，其中TTG 十分保守。 -35 序列的功能：它是原核 RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点。因此，-35 序列对 RNA 聚合酶 全酶有很高的亲和性。-35 序列的核苷酸结构，在很大程度上决定了启动子的强度，RNA聚合酶易识别强的 启动子。 -35 序列提供RNA聚合酶识别信号， -10 序列有助于DNA 局部双链解开， 启动子结构的不对称性决定了转录的方向。 P364 图 20-4 原核型启动子的结构
真核启动子 真核基因的转录十分复杂,对启动子的分析要比原核基因的困难得多。 真核生物有三种RNA聚合酶:RNA聚合酶I、Il、Ⅲ,分别转录rNA、mRNA、tRNA和小分子RNA 这三类聚合酶的启动子各有其结构特点 l、RNA聚合酶Ⅱ的启动子 RNA聚合酶Ⅱ的启动子有三个保守区 (1)、TATA框( Hogness框) 中心在-25至30,长度bp左右 碱基频率:T8A9A8sA63(T37)A83A50(T37)(全为A-T,少数含有一个GC对)。 此序列功能:使DNA双链解开,并决定转录的起点位置,失去TAIA框,转录将可能在许多位点上开 TAIA框的改变或缺失,直接景响DNA与酶的结合程度,会使转录起始点偏移,因此,TATA是绝大多 数真核基因正确表达所必需的 由于RNA聚合酶分子有相对固定的空间结构,同此框的结合位点和转录反应催化位点的距离,决定了 起始位点的正确选择。启动子特定序列和酶的正确结构,这两者把酶置于种正确的构象中,决定了识别的 正确性和转录起始的正确性。 (2)、cAT框 中心在75处,9p,共有序列G(T(G) CAATCT 功能:与RNA聚合酶结合 在CAAT框上游,序列 GGGCGG,与某些转录因子结合。 CAAT和GC框均为上游序列,对转录的起始频率有较大景响 2、 RNApolⅢ的启动子 RNApoll的启动子在转录区内部 P365图205由RNA聚合酶Ⅲ转录的三个基因的启动 四、终止子和终止因子 终止子:提供转录终止信号的一段DNA序列。 终止因子:协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。 有些终止子的作用可被特异的因子所阻止,使酶越过终止子继续转录,称为通读,这类引起抗终止作用 的蛋白质称为抗终止因子。 终止子位于己转录的序列中,DNA的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子识别。 P366图206
５ （二） 真核启动子 真核基因的转录十分复杂，对启动子的分析要比原核基因的困难得多。 真核生物有三种 RNA 聚合酶：RNA聚合酶I、II、III，分别转录 rRNA、mRNA、tRNA 和小分子 RNA， 这三类聚合酶的启动子各有其结构特点。 1、 RNA 聚合酶Ⅱ的启动子 RNA 聚合酶Ⅱ的启动子有三个保守区： （1）、 TATA 框（Hogness 框） 中心在-25 至-30，长度7bp 左右。 碱基频率：T82A97A85A63 （T37 ）A83A50（T37 ）（全为A-T，少数含有一个G-C 对）。 此序列功能：使 DNA 双链解开，并决定转录的起点位置，失去 TATA 框，转录将可能在许多位点上开 始。 TATA 框的改变或缺失，直接影响 DNA与酶的结合程度，会使转录起始点偏移，因此，TATA 是绝大多 数真核基因正确表达所必需的。 由于 RNA 聚合酶分子有相对固定的空间结构，同此框的结合位点和转录反应催化位点的距离，决定了 起始位点的正确选择。启动子特定序列和酶的正确结构，这两者把酶置于一种正确的构象中，决定了识别的 正确性和转录起始的正确性。 （2）、 CAAT 框 中心在-75 处，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT 功能：与 RNA 聚合酶结合。 （3）、 GC 框 在 CAAT框上游，序列GGGCGG，与某些转录因子结合。 CAAT和GC 框均为上游序列，对转录的起始频率有较大影响。 2、 RNApolⅢ的启动子 RNApolⅢ的启动子在转录区内部。 P365 图 20-5 由 RNA 聚合酶III 转录的三个基因的启动子 四、 终止子和终止因子 终止子：提供转录终止信号的一段DNA 序列。 终止因子：协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。 有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶越过终止子继续转录，称为通读，这类引起抗终止作用 的蛋白质称为抗终止因子。 终止子位于已转录的序列中，DNA的终止子可被RNA 聚合酶本身或其辅助因子识别。 P366 图 20-6