蛋白质的一级结构(共价结构) 蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构 蛋白质结构层次 级结构(氨基酸顺序、共价结构、主链结构) ↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序 二级结构 超二级结构 构象(高级结构) 结构域 三级结构(球状结构) 四级结构(多亚基聚集体) 一级结构的要点 蛋白质测序的一般步骤 祥见P116 (1)测定蛋白质分子中多肽链的数目 (2)拆分蛋白质分子中的多肽链。 (3)测定多肽链的氨基酸组成。 (4)断裂链内二硫键。 (5)分析多肽链的N末端和C末端。 (6)多肽链部分裂解成肽段 (7)测定各个肽段的氨基酸顺序 (8)确定肽段在多肽链中的顺序 (9)确定多肽链中二硫键的位置 蛋白质测序的基本策略 对于一个纯蛋白质,理想方法是从N端直接测至C端,但目前只能测60个N端氨基酸
蛋白质的一级结构（共价结构） 蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。 蛋白质结构层次 一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构） ↓ 是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序 二级结构 ↓ 超二级结构 ↓ 构象（高级结构） 结构域 ↓ 三级结构(球状结构) ↓ 四级结构(多亚基聚集体) 一级结构的要点 ． 蛋白质测序的一般步骤 祥见 P116 （1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成。 （4） 断裂链内二硫键。 （5） 分析多肽链的 N 末端和 C 末端。 （6） 多肽链部分裂解成肽段。 （7） 测定各个肽段的氨基酸顺序 （8） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （9） 确定多肽链中二硫键的位置。 蛋白质测序的基本策略 对于一个纯蛋白质，理想方法是从 N 端直接测至 C 端，但目前只能测 60 个 N 端氨基酸
直接法(测蛋白质的序列) 两种以上特异性裂解法 N A法裂解A1_A2A3_A4 B法裂解B1B 用两种不同的裂解方法,产生两组切点不同的肽段,分离纯化每一个肽段,分离测定两个肽 段的氨基酸序列,拼接成一条完整的肽链 间接法(测核酸序列推断氨基酸序列) 核酸测序,一次可测600-800bp 测序前的准备工作 蛋白质的纯度鉴定 纯度要求,97%以上,且均一,纯度鉴定方法。(两种以上才可靠) (1)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带 (2)DNS-cl(二甲氨基萘磺酰氯)法测N端氨基酸 测定分子量 用于估算氨基酸残基n=m 110 方法:凝胶过滤法、沉降系数法 确定亚基种类及数目 多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式 (1)非共价键结合 8mol/L尿素,SDS SDS-PAGE测分子量 (2)二硫键结合 过甲酸氧化 - +HCOOOI SO3H β巯基乙醇还原 举例::血红蛋白(a2B2) (注意,人的血红蛋白a和B的N端相同。) 分子量:M 拆亚基:M1、M2 两条带 拆二硫键:M1、M2 两条带 分子量关系:M=2M1+2M2 测定氨基酸组成 主要是酸水解,同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。 确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。 ①Trp测定 对二甲基氨基苯甲醛590nm
直接法（测蛋白质的序列） 两种以上特异性裂解法 N C A 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4 用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽 段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列） 核酸测序，一次可测 600-800bp 测序前的准备工作 蛋白质的纯度鉴定 纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。（两种以上才可靠） ⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带 ⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测 N 端氨基酸 测定分子量 用于估算氨基酸残基 n= 方法：凝胶过滤法、沉降系数法 确定亚基种类及数目 多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式： ⑴非共价键结合 8mol/L 尿素，SDS SDS-PAGE 测分子量 ⑵二硫键结合 过甲酸氧化： —S—S—+HCOOOH → SO3H β巯基乙醇还原： 举例:： 血红蛋白 (α2β2) （注意，人的血红蛋白α和β的 N 端相同。） 分子量： M 拆亚基： M1 、M2 两条带 拆二硫键： M1 、M2 两条带 分子量关系： M = 2M1 + 2M2 测定氨基酸组成 主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。 确定肽链中各种 a.a 出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。 ①Trp 测定 对二甲基氨基苯甲醛 590nm。 110 mw
②Cys测定 5、5一二硫代双(-2—硝基苯甲酸)DTNB,412nmn 端基分析 ①N端分析 DNS-cl法:最常用,黄色荧光,灵敏度极高,DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提 DNFB法: Sanger试剂,DNP-多肽,酸水解,黄色DNP-氨基酸,有机溶剂(乙酸乙酯) 抽提分离,纸层析、薄层层析、液相等 PIT法: Edman法,逐步切下。无色PTH-氨基酸,有机溶剂抽提,层析。 ②C端分析 A.肼解法 HLN-A-BC- D-COOH无水肼NHN2100℃5-10h H2、D-COOH 氨基酸的酰肼,用苯甲醛沉淀,C端在上清中,Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。 B.羧肽酶法(Pro不能测) 羧肽酶A:除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a 羧肽酶B:只水解Arg、Lys NH2N… .Val--Ser-Gly C 图P118羧肽酶法测C末端 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化 化学裂解法 ①溴化氰 产率85% ②亚碘酰基苯甲酸 产率70-100% 8NTCB(2硝基-5-硫氰苯甲酸)-xCy↓ 羟胺NH2OH 约150个氨基酸出现一次 酶法裂解 ①胰蛋白酶 (X≠Pro) ②胰凝乳蛋白酶 (X≠Pro) Phe-—X 胃蛋白酶
②Cys 测定 5、5 /一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB ，412nm 端基分析 ①N 端分析 DNS-cl 法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的 DNS-氨基酸不需要提 取。 DNFB 法：Sanger 试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色 DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯） 抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等 PITC 法：Edman 法，逐步切下。无色 PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。 ②C 端分析 A．肼解法 H2N-A-B-C-D-COOH 无水肼 NH2NH2 100℃ 5-10h。 A-NHNH2 、 B-NHNH2 、 C-NHNH2 、 D-COOH 氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C 端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg 不能用此法。 B．羧肽酶法（Pro 不能测） 羧肽酶 A：除 Pro、Arg、Lys 外的所有 C 端 a.a 羧肽酶 B：只水解 Arg、Lys N H2N… … … … …Val—Ser—Gly C 图 P118 羧肽酶法测 C 末端 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化 化学裂解法 ①溴化氰 —Met—X— 产率 85% ②亚碘酰基苯甲酸 —Trp—X— 产率 70-100% ③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys— ④羟胺 NH2OH —Asn—Gly— 约 150 个氨基酸出现一次 酶法裂解 ①胰蛋白酶 Lys X (X ≠ Pro) Arg—— X ②胰凝乳蛋白酶 Tyr——X (X ≠ Pro) Trp——X Phe——X 胃蛋白酶 Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)
③Glu蛋白酶 Glu—X V蛋白酶) ④Arg蛋白酶 ⑤Lys蛋白酶 ⑥Pro蛋白酶 Pr 肽段的分离纯化 ①电泳法SDS-PAGE 根据分子量大小分离 ②离子交换层析法(DEAE- Cellulose、DEAE- Sephadex) 根据肽段的电荷特性分离 ③反相HPLC法 根据肽段的极性分离 ④凝胶过滤 肽段纯度鉴定 分离得到的每一个肽段,需分别鉴定纯度,常用DNS-c1法 要求:SDS一PAGE单带、HPLC单峰、N端单 肽段的序列测定及肽链的拼接 Edman法 次水解一个N端a.a (1)耦联 PITC+H2N-A-B-C-D…pB8=9,40℃PTC→A-B-C-D… (2)裂解 PTC-A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸 ATZ—A+H2NB-C-D (3)转化 PTH—A 用GC或HPLC测定PTHA PTC肽:苯氨基硫甲酰肽 ATZ:噻唑啉酮苯胺(一氨基酸) PTH:苯乙内酰硫脲(一氨基酸) 稱耦联:得PTC肽 次循环裂解:ATZ-a 转化:PTH-aa 反应产率99%循环次数120 (偶联、降98% 解两步)90% DNS- Edman法 用DNS法测N末端,用 Edman法提供(n-1)肽段 A-B-C-D一E肽
③Glu 蛋白酶 Glu——X （V8 蛋白酶） ④Arg 蛋白酶 Arg——X ⑤Lys 蛋白酶 X——Lys ⑥Pro 蛋白酶 Pro——X 肽段的分离纯化 ①电泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 根据分子量大小分离 ②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex） 根据肽段的电荷特性分离 ③反相ＨＰＬＣ法 根据肽段的极性分离 ④凝胶过滤 肽段纯度鉴定 分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－c l 法 要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。 肽段的序列测定及肽链的拼接 Edman 法 一次水解一个Ｎ端 a.a （1）耦联 PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9 ，40℃ PTC——A-B-C-D…… （2）裂解 PTC—A-B-C-D……TFA 无水三氟乙酸 ATZ—A + H2N—B-C-D （3）转化 ATZ—A PTH—A 用 GC 或 HPLC 测定 PTH-A PTC 肽：苯氨基硫甲酰肽 ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸） PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸） 耦联：得 PTC 肽 一次循环 裂解：ATZ- a.a 转化：PTH-a.a 反应产率 99％ 循环次数 120 (偶联、降 98% 60 解两步） 90% 40 DNS-Edman 法 用 DNS 法测 N 末端，用 Edman 法提供（n-1）肽段。 Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽
图 有色 Edman法 荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。 用自动序列分析仪测序 仪器原理: Edman法,可测60肽。 1967液相测序仪 自旋反应器,适于大肽段。 1971固相测序仪 表面接有丙氨基的微孔玻璃球,可耦连肽段的C端。 1981气相测序仪 用 Polybrene反应器 (聚阳离子)四级铵盐聚合物 液相:5nmol20-40肽97% 气相:5pmol 肽 肽段拼接成肽链 16肽,N端HC端 A法裂解: ONS PS EOVE RLA HOWT B法裂解: SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定序列: HOW TONSEOVER LAPS 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定 二硫键的确定(双向电泳法) 碘乙酰胺封闭-SH 胃蛋白酶酶解蛋白质 第一向电泳 过甲酸氧化一S—S—生成-SOH 第二向电泳 分离出含二硫键的两条短肽,测 与拼接出的肽链比较,定出二硫键的位置 酰胺的确定 酶解肽链,产生含单个Asx或Glx的肽,用电泳法确定是Asp还是Asn 举例:Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时,电荷量是Leu'Pro°al 此肽除Glx外,净电荷为0,可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln 糖、脂、磷酸基位置的确定 糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接,-N-糖苷-0-糖苷 脂类:Ser、Thr、Cys 磷酸:Ser、Thr、His 经验性序列:Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO)
图 有色 Edman 法 荧光基团或有色试剂标记的 PITC 试剂。 用自动序列分析仪测序 仪器原理：Edman 法，可测 60 肽。 1967 液相测序仪 自旋反应器，适于大肽段。 1971 固相测序仪 表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。 1981 气相测序仪 用 Polybrene 反应器。 （聚阳离子）四级铵盐聚合物 液相：5nmol 20-40 肽 97% 气相：5pmol 60 肽 98% 肽段拼接成肽链 16 肽，Ｎ端 H Ｃ端Ｓ Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定 二硫键的确定（双向电泳法） 碘乙酰胺封闭-SH 胃蛋白酶酶解蛋白质 第一向电泳 过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H 第二向电泳 分离出含二硫键的两条短肽，测序 与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。 酰胺的确定 Asp –Asn、Glu-Gln 酶解肽链，产生含单个 Asx 或 Glx 的肽，用电泳法确定是 Asp 还是 Asn 举例：Leu-Glx-Pro-Val 肽在 pH=6.0 时，电荷量是 Leu + Pro0 Val- 此肽除 Glx 外，净电荷为 0，可根据此肽的电泳行为确定是 Glu 或是 Gln。 糖、脂、磷酸基位置的确定 糖类通过 Asn、Ser 与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖苷 脂类：Ser、 Thr、Cys 磷酸：Ser、 Thr、His 经验性序列： Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)