单细胞悬液的制备分离单个细胞是单细胞测序工作流程的第一步，而准备单细胞悬液是分离单个细胞的前提（1）酶消化法：酶的作用原理主要有三方面，一是破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等，二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质，三是水解组织粘多糖物质2）机械法：机械法分散实体组织包括用剪刀剪碎组织或用锋常见单细胞悬液制备的方法一利的解部刀剃碎组织，用匀浆器匀浆，用线注射针头反复抽吸细胞等。（3）化学处理法：其主要原理是将组织细胞间起到粘连作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。此方法获得的细胞存活率低，细胞产量低，细胞碎片和细胞聚集量不稳定
单细胞悬液的制备 ➢ 分离单个细胞是单细胞测序工作流程的第一步，而准备单细胞悬液是分离单个细胞的前提。 常见单细胞悬液制备的方法 （1）酶消化法：酶的作用原理主要有三方面，一是破坏组织间 的胶原纤维、弹性纤维等，二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋 白质，三是水解组织粘多糖物质。 （2）机械法：机械法分散实体组织包括用剪刀剪碎组织或用锋 利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，用线注射针头反复抽吸细胞 等。 （3）化学处理法：其主要原理是将组织细胞间起到粘连作用的 钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。此方法获得的细胞存 活率低，细胞产量低，细胞碎片和细胞聚集量不稳定
单细胞悬液的制备常见样本类型的单细胞悬液制备方法及步骤单细胞悬液制备外周血样本固体组织贴壁细胞肝素抗凝的静脉血稀释切碎组织针对不同的样本类型，如胰蛋白酶进行消化酶消化分解细胞附着物加人淋巴细胞分离液何获取活性高、完整性好血清终止结团率低的单细胞悬浮液？离心酶解和机械分解★中间白色云雾层狭窄带过滤过滤反复洗涤后调至合适浓度
单细胞悬液的制备 常见样本类型的单细胞悬液制备方法及步骤 针对不同的样本类型，如 何获取活性高、完整性好、 结团率低的单细胞悬浮液？
单细胞悬液的制备推荐使用样本类型：1）心脏，肌肉，脂肪，巨核细胞：细胞新鲜样本很难获取直径大于40μm，常规解离成单细胞悬液容易造成捕获芯片堵塞冻存的组织无法制备高质量细胞悬液2）肝脏：肝实质细胞太脆弱处理过程中细胞过于脆弱、易降解单细胞水平上的容易破裂，常规解离细胞碎片过多；核转录组测序在捕获时容易破裂3）脑神经：组织中含有大里髓鞘结构(snRNA-seq）：把组织抽核，制备且细胞形状不规则，消化过程中会产生过多细胞形状不规则成单细胞核悬液的杂质背景；含酶量丰富4）胰腺：组织自身含酶里高，组织解离解离过程中应激基因容易表达过程中易导致细胞活性较差：5）冻存肿瘤组织（不关注免疫细胞），细胞直径过大，难以捕获软骨样本：组织冻存后细胞膜受损，无法得到合格的单细胞悬液
单细胞悬液的制备 新鲜样本很难获取 冻存的组织无法制备高质量细胞悬液 细胞过于脆弱、易降解 在捕获时容易破裂 细胞形状不规则 含酶量丰富 解离过程中应激基因容易表达 细胞直径过大，难以捕获 . 单细胞水平上的 核转录组测序 （snRNA-seq）： 把组织抽核，制备 成单细胞核悬液 推荐使用样本类型： 1）心脏，肌肉，脂肪，巨核细胞：细胞 直径大于40μm，常规解离成单细胞悬液容 易造成捕获芯片堵塞； 2）肝脏：肝实质细胞太脆弱处理过程中 容易破裂，常规解离细胞碎片过多； 3）脑神经：组织中含有大里髓鞘结构， 且细胞形状不规则，消化过程中会产生过多 的杂质背景； 4）胰腺：组织自身含酶里高，组织解离 过程中易导致细胞活性较差； 5）冻存肿瘤组织（不关注免疫细胞）， 软骨样本：组织冻存后细胞膜受损，无法得 到合格的单细胞悬液
单细胞的分离制备好单细胞悬液后，需要选取合适的单细胞分选方法将单个细胞分离分析梯度稀释挑选移液自动显微操作低通量方法激光捕获显微切割根据细胞通量来区分FACS微孔技术高通量方法液滴微流控技术组合编码技术
单细胞的分离 ➢ 制备好单细胞悬液后，需要选取合适的单细胞分选方法将单个细胞分离分析。 根据细胞通量来区分 低通量方法 高通量方法 ⚫ 梯度稀释 ⚫ 挑选移液 ⚫ 自动显微操作 ⚫ 激光捕获显微切割 ⚫ FACS ⚫ 微孔技术 ⚫ 液滴微流控技术 ⚫ 组合编码技术
传统单细胞分离技术一口吸/手动挑选法由倒置显微镜和可通过电动机械平台移动的微移液器组成，微量移液器由超薄玻璃毛细管制成，与抽吸和分配装置相连》细胞样品通常以培养血或孔板中的悬浮液形式提供。》通过显微镜观察，操作员选择一个特定的细胞，将微量移液管靠近并通过对微量移液器施加吸力来吸出细胞
传统单细胞分离技术——口吸/手动挑选法 ➢ 由倒置显微镜和可通过电动机械平台移动的微移液器组成，微量移液器由超薄玻璃毛细管制 成，与抽吸和分配装置相连。 ➢ 细胞样品通常以培养皿或孔板中的悬浮液形式提供。 ➢ 通过显微镜观察，操作员选择一个特定的细胞，将微量移液管靠近并通过对微量移液器施加 吸力来吸出细胞