实验十二、线粒体的分级分离及电子传递的检测一、实验目的：1、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法：2、对分离得到的线粒体进行电子传递的检测
一、实验目的： 1、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法； 2、对分离得到的线粒体进行电子传递的检测 实验十二、线粒体的分级分离及电子传 递的检测
二、实验原理细胞器分离基本步骤分离、纯化细胞器鉴定细胞破碎（一）细胞破碎的方法1.杆状玻璃匀浆器法2.高速组织捣碎机法3.超声波处理法4.化学裂解法5.反复冻融法
细胞器分离基本步骤 二、实验原理 细胞破碎 分离、纯化 细胞器鉴定 （一）细胞破碎的方法 1.杆状玻璃匀浆器法 2.高速组织捣碎机法 3.超声波处理法 4.化学裂解法 5.反复冻融法
细胞破碎的注意事项：1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液（0.25mol/L）。它比较接近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解
细胞破碎的注意事项： 1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液 （0.25mol/L ）。它比较接近细胞质的分散相，具有 足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小， 在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。 2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中 的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解
（二）分离纯化的方法根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法主要包括差速离心、密度梯度离心等方法
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心 成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮 力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。 主要包括差速离心、密度梯度离心等方法
差速离心法（Differentialcentrifugation根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系数相差较大（10倍及以上）的颗粒
根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别， 分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方 法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降 系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。 差速离心法 (Differential centrifugation)