视配 8.PHA溶液：取粉剂PH1支(10mg),溶于2ml无菌生理盐水中，使用 时每5ml培养液加0.2`0.3ml,使培养液中PHA的浓度达到200`300ug/ml (其他溶液配制参附录)。 (三)人微量外周血淋巴细胞培养 1、采血：用2.5m1一次性注射器抽取肝素使用液0.2m1:湿润针管， 然后将多余的肝素排除。常规消毒被检查者肘部皮肤，从肘部静脉采血】 毫升。 2、接种：在无菌室或超净工作台内按无菌操作将抽得的抗凝血分装于 2个含培养液的培养瓶中（可将针头直接插入培养瓶的橡皮塞注入血液 0.3~0.5ml)。轻轻摇匀。 3、培养：将接种了人血的培养瓶放入隔水式恒温培养箱中，37℃培养 72小时。 (四)染色体标本的制备 1、秋水仙素处理：在收获细胞前3~4小时用1ml注射器（装5号针头） 加入浓度为5μg/ml的秋水仙素2滴，使培养液中的秋水仙素终浓度为 0.05μg/ml。轻轻摇匀，放回培养箱中继续培养34小时 2、终止培养（收获细胞）：取出培养瓶，用吸管将培养物混匀，并移 至10ml刻度离心管内，平衡后放入离心机，以1000r/min离心8~10分钟 吸弃上清液。 3、低渗处理：往离心管中加入8ml预温至37℃的0.075mol/L的KC1, 用吸管混合均匀，置37℃恒温水浴箱中低渗10~25分钟（精确的低渗时间 应自行摸索) 4、周定： ①预固定：低渗处理完成后，加入1l新配制的固定液并混合均匀，放 入离心机，以1000r/min离心8一10分钟。吸弃上清夜。 ②固定：加入81固定液，用吸管将沉淀的细胞轻轻混合成细胞悬液， 1000r/min离心8-10分钟。吸弃上清液. ③再固定：加入8ml固定液，用吸管轻轻吹打使细胞混匀，l000r/mi 离心810分钟，吸弃上清液。 5、制片：视离心管中沉淀（细胞）的多少加入0.2~0.4l左右的固 定液，用吸管轻轻混成细胞悬液（混合后固定液呈少许乳白色即表示细胞浓 度适当)。用吸管吸取细胞悬液以35cm高的距离滴至冷冻的载玻片上，每 片滴2~3滴，立即对准玻片吹一口气以助细胞的分散并立即将玻片在酒精 灯火焰上来回过几下（勿全烤干），空气中晾干。 6
6 Na2HPO4 .2H20），KH2PO4 4.50g 溶于 1000ml 蒸馏水中即成。 7.固定液：用 3 份甲醇和 1 份醋酸混合而成，现用现配。 8.PHA 溶液：取粉剂 PHA1 支（10mg），溶于 2ml 无菌生理盐水中，使用 时每 5ml 培养液加 0.2 ~ 0.3ml，使培养液中 PHA 的浓度达到 200 ~ 300ug/ml （其他溶液配制参附录）。 （三）人微量外周血淋巴细胞培养 1、采血：用 2.5ml 一次性注射器抽取肝素使用液 0.2ml；湿润针管， 然后将多余的肝素排除。常规消毒被检查者肘部皮肤，从肘部静脉采血 1 毫升。 2、接种：在无菌室或超净工作台内按无菌操作将抽得的抗凝血分装于 2 个含培养液的培养瓶中（可将针头直接插入培养瓶的橡皮塞注入血液 0.3～0.5 ml）。轻轻摇匀。 3、培养：将接种了人血的培养瓶放入隔水式恒温培养箱中，37℃培养 72 小时。 （四）染色体标本的制备 l、秋水仙素处理：在收获细胞前 3～4 小时用 lml 注射器（装 5 号针头） 加入浓度为 5μg／ml 的秋水仙素 2 滴，使培养液中的秋水仙素终浓度为 0.05μg／ml。轻轻摇匀，放回培养箱中继续培养 3~4 小时。 2、终止培养（收获细胞）：取出培养瓶，用吸管将培养物混匀，并移 至 10ml 刻度离心管内，平衡后放入离心机，以 1000r／min 离心 8～10 分钟， 吸弃上清液。 3、低渗处理：往离心管中加入 8ml 预温至 37℃ 的 0.075mol／L 的 KCl， 用吸管混合均匀，置 37℃恒温水浴箱中低渗 10～25 分钟（精确的低渗时间 应自行摸索） 4、固定： ①预固定：低渗处理完成后，加入 lml 新配制的固定液并混合均匀，放 入离心机，以 1000r/min 离心 8～10 分钟。吸弃上清液。 ②固定：加入 8ml 固定液，用吸管将沉淀的细胞轻轻混合成细胞悬液， 1000r／min 离心 8～10 分钟。吸弃上清液。 ③再固定：加入 8ml 固定液，用吸管轻轻吹打使细胞混匀，1000r／min 离心 8～10 分钟，吸弃上清液。 5、制片：视离心管中沉淀（细胞）的多少加入 0.2～0.4 ml 左右的固 定液，用吸管轻轻混成细胞悬液（混合后固定液呈少许乳白色即表示细胞浓 度适当）。用吸管吸取细胞悬液以 35cm 高的距离滴至冷冻的载玻片上，每 片滴 2～3 滴，立即对准玻片吹一口气以助细胞的分散并立即将玻片在酒精 灯火焰上来回过几下（勿全烤干），空气中晾干
6、染色：如果所制备的标本用于染色体的非显带分析，则将晾干的玻 片标本用Giemsa染液（用l份Giemsa原液加9份plH6.8的磷酸缓冲液混合 而成)染色5~10分钟。在自来水管下用细水轻轻冲洗晾干。 7、镜检：将所制备人染色体玻片放到显微镜下，先用低倍镜寻找染色 体分散良好的中期分裂相转换油镜仔细观察（参考第七章中染色体照片）。 (五)注意事项 1.培养箱的温度应严格控制在37±0.5℃。 2.培养基的H值应调整到7.2~7.4之间，偏酸时细胞发有不良，偏 碱时细胞会出现轻度固缩。 3。在采血或接种时，注意不要使用太多的肝素，因为肝素过多会抑制 淋巴细胞的转化，但也不宜太少，否则出现凝血现象。如果培养物中出现膜 状凝块，可轻摇培养瓶使凝块散开。4.注意盖紧培养瓶口，以免培养过程中 培养液的山发生较大变化。如果培养液变黄，说明偏酸，此时可加入无菌 的2%aHC0,溶液或另加2~3毫升培养液进行调整。 5.PA的质与量是人体淋巴细胞培养成败的关键，一般使用量为每毫 升培养液200~300微克（市售10毫克安瓿装P用2毫升生理盐水稀释， 每瓶培养物加0.2~0.3毫升)。由于不同米源和保存时间不同的PH其效价 会有差异，所以，精确的其用量应自行摸索。PHA的量也不宜过大，否则会 导致红细胞疑集。 6.所用的玻璃器皿都应十分洁净，各种试剂尽量选用分析纯的 7.配制培养液等溶液所用的双蒸水宜用玻璃蒸馏器制备。 8.离心机最好用水平式的，速度宜用1000~2000pm,如太高，沉降 在管底的细胞团不宜打散：太低，分裂相容易丢失。如果低渗后离心速度过 高，则会使分裂细胞过早破裂，在最后制成的标本中，完整分裂相过少。 9.秋水仙素的处理时间和使用浓度，应随实验的要求而异。若从能得 到足够量的中期分裂相考虑，秋水仙素的处理时间宜长些，所用的浓度宜高 些：但从能得到较为细长的染色体（便于分带）考虑，处理时间宜短些，所 用浓度宜低些。应注意，秋水仙素用量过多或作用时间过长，会导致染色体 过分收缩或着丝粒分离，甚至染色体破碎。 10.收获前的所有操作过程应保持高度的无菌概念，严防细菌和病毒的 污染。 11.低渗时间的长短关系到染色体分散的好坏，精确的时间应自行摸 索。 12.固定液应现配现用，固定应彻底，吹打要均匀，用力不要过猛，以 避免细胞破裂，染色体丢失。 13.固定剂也可用乙醇和冰酷酸混合(3：1)，但甲醇的使用较乙醇更 为广泛，因为甲醇可使标本更为清晰，但要注意的是这种固定剂应现配现用， 存放后会产生沉淀，影响固定的效果
7 6、染色：如果所制备的标本用于染色体的非显带分析，则将晾干的玻 片标本用 Giemsa 染液（用 1 份 Giemsa 原液加 9 份 pH6.8 的磷酸缓冲液混合 而成）染色 5～10 分钟。在自来水管下用细水轻轻冲洗晾干。 7、镜检：将所制备人染色体玻片放到显微镜下，先用低倍镜寻找染色 体分散良好的中期分裂相转换油镜仔细观察（参考第七章中染色体照片）。 （五）注意事项 1. 培养箱的温度应严格控制在 37±0.5℃。 2. 培养基的 pH 值应调整到 7.2～7.4 之间，偏酸时细胞发育不良，偏 碱时细胞会出现轻度固缩。 3. 在采血或接种时，注意不要使用太多的肝素，因为肝素过多会抑制 淋巴细胞的转化，但也不宜太少，否则出现凝血现象。如果培养物中出现膜 状凝块，可轻摇培养瓶使凝块散开。4.注意盖紧培养瓶口，以免培养过程中 培养液的 pH 发生较大变化。如果培养液变黄，说明偏酸，此时可加入无菌 的 2%NaHCO3 溶液或另加 2～3 毫升培养液进行调整。 5. PHA 的质与量是人体淋巴细胞培养成败的关键，一般使用量为每毫 升培养液 200～300 微克（市售 10 毫克安瓿装 PHA 用 2 毫升生理盐水稀释， 每瓶培养物加 0.2～0.3 毫升）。由于不同来源和保存时间不同的 PHA 其效价 会有差异，所以，精确的其用量应自行摸索。PHA 的量也不宜过大，否则会 导致红细胞凝集。 6. 所用的玻璃器皿都应十分洁净，各种试剂尽量选用分析纯的。 7. 配制培养液等溶液所用的双蒸水宜用玻璃蒸馏器制备。 8. 离心机最好用水平式的，速度宜用 1000～2000rpm，如太高，沉降 在管底的细胞团不宜打散；太低，分裂相容易丢失。如果低渗后离心速度过 高，则会使分裂细胞过早破裂，在最后制成的标本中，完整分裂相过少。 9. 秋水仙素的处理时间和使用浓度，应随实验的要求而异。若从能得 到足够量的中期分裂相考虑，秋水仙素的处理时间宜长些，所用的浓度宜高 些；但从能得到较为细长的染色体（便于分带）考虑，处理时间宜短些，所 用浓度宜低些。应注意，秋水仙素用量过多或作用时间过长，会导致染色体 过分收缩或着丝粒分离，甚至染色体破碎。 10. 收获前的所有操作过程应保持高度的无菌概念，严防细菌和病毒的 污染。 11. 低渗时间的长短关系到染色体分散的好坏，精确的时间应自行摸 索。 12. 固定液应现配现用，固定应彻底，吹打要均匀，用力不要过猛，以 避免细胞破裂，染色体丢失。 13. 固定剂也可用乙醇和冰醋酸混合（3：1），但甲醇的使用较乙醇更 为广泛，因为甲醇可使标本更为清晰，但要注意的是这种固定剂应现配现用， 存放后会产生沉淀，影响固定的效果
14.制片中如发现染色体分散不佳，可重复固定或延长固定时间。 15.滴片时如玻片冷却不够或有油污会影响细胞和染色体的分散.要使 染色体分散良好，还要注意细胞的浓度和滴片的技巧等。 16.培养失败的常见原因：①培养瓶等器材未清洗干净：②培养用水不 合要求：③H值不合适：④细菌污染：⑤PHA质量有问题：⑥细胞免疫水平 低下。 五、作业与思考 1.染色体制备的原理是什么？ 2.染色体制备过程应注意哪些问题？ 3.染色体制备过程有哪些是重要步骤？ (刘京昇许风华)
8 14. 制片中如发现染色体分散不佳，可重复固定或延长固定时间。 15. 滴片时如玻片冷却不够或有油污会影响细胞和染色体的分散。要使 染色体分散良好，还要注意细胞的浓度和滴片的技巧等。 16. 培养失败的常见原因：①培养瓶等器材未清洗干净；②培养用水不 合要求；③pH 值不合适；④细菌污染；⑤PHA 质量有问题；⑥细胞免疫水平 低下。 五、作业与思考 1. 染色体制备的原理是什么？ 2. 染色体制备过程应注意哪些问题？ 3. 染色体制备过程有哪些是重要步骤？ （刘京昇 许风华）
实验三人类非显带染色体核型分析 一、实验目的 1、熟悉人类染色体的数目及形态特征 2、掌握非显带染色体的核型分析方法。 二、实验原理 人类非显带染色体核型分析是染色体研究的一项基本内容。它的一般 程序是先利用显微镜照相装置拍摄人类非显带染色体的图像。并放大成染 名休昭片 然后按照国际上统一的标准。将人的46条染色体分成7个组 并编上号。然后将染色体剪贴到专门的报告单上制成染色体核型 (karyotype)图。并检查正常与否，这个过程就称为核型分折。利用核 型分析可以检查某人的染色体数目是否正常。并可发现较大的染色体结构 畸变以及判定性别等。 一个曲型的中期细色体都口纵裂成条伍单体，称地色单 体，由 个者丝粒相连 。每条染色体以着丝粒为界可分 为长 短两个臂 根据着丝粒位置的不同，可将人类的染色体分为中央着丝粒染色体、亚中 央着丝粒染色体和近端着丝粒染色体三类。 三、实验用品 1、器材：光学显微镜、小剪刀、小镊子、胶水、香柏油、擦镜纸 核型分析纸。 2、材料：常规制备的正常人体染色体标本。正常人中期染色体照 片。 四、实验内容与方法 (一)正常人体细胞染色体的观察及计数 取正常人染色体玻片放到显微镜下，先用低倍镜寻找染色体分散良好 的中期分裂相转换油镜仔细观察。 镜下可见，正常人的每一体细胞都含有46条染色体，其中有22对是 男女共有的：称为常染色体(autosome),另外1对则男女相差很大，称 为性染色体(sex some)。每个同学观察2~3个分裂相，并寻找 10个分散良好的分裂相进行染色体计数， 计数前，先按染色体自然分布的图形大致分为几个区域，分别计数 每区的染色体条数，然后加起来即为该细胞的染色体总数。 (二)显微镜下的核型分析 用低倍镜选择分散良好的中期分裂相，在高倍镜下再检查一下中期 分裂相的质量，分散差的、分散过度的 分散的圆形轮廓不太完整的 有染色体重叠的、染色体着色差的或与其它分裂相太靠近的都不要。转 9
9 实验三 人类非显带染色体核型分析 一、实验目的 1、熟悉人类染色体的数目及形态特征。 2、掌握非显带染色体的核型分析方法。 二、实验原理 人类非显带染色体核型分析是染色体研究的一项基本内容。它的一般 程序是先利用显微镜照相装置拍摄人类非显带染色体的图像。并放大成染 色体照片．然后按照国际上统一的标准。将人的 46 条染色体分成 7 个组 并编上号。然后将染色体剪贴到专门的报告单上制成染色体核型 （karyotype）图。并检查正常与否，这个过程就称为核型分折。利用核 型分析可以检查某人的染色体数目是否正常。并可发现较大的染色体结构 畸变以及判定性别等。 一个典型的中期细胞染色体都已纵裂成 2 条染色单体，称姐妹染色单 体，由一个着丝粒相连。每条染色体以着丝粒为界可分为长、短两个臂。 根据着丝粒位置的不同，可将人类的染色体分为中央着丝粒染色体、亚中 央着丝粒染色体和近端着丝粒染色体三类。 三、实验用品 1、器材：光学显微镜、小剪刀、小镊子、胶水、香柏油、擦镜纸、 核型分析纸。 2、材料：常规制备的正常人体染色体标本。正常人中期染色体照 片。 四、实验内容与方法 （一）正常人体细胞染色体的观察及计数 取正常人染色体玻片放到显微镜下，先用低倍镜寻找染色体分散良好 的中期分裂相转换油镜仔细观察。 镜下可见，正常人的每一体细胞都含有 46 条染色体，其中有 22 对是 男女共有的；称为常染色体（autosome），另外 1 对则男女相差很大，称 为性染色体（sex chromosome）。每个同学观察 2～3 个分裂相，并寻找 10 个分散良好的分裂相进行染色体计数。 计数前，先按染色体自然分布的图形大致分为几个区域，分别计数 每区的染色体条数，然后加起来即为该细胞的染色体总数。 （二）显微镜下的核型分析 用低倍镜选择分散良好的中期分裂相，在高倍镜下再检查一下中期 分裂相的质量，分散差的、分散过度的、分散的圆形轮廓不太完整的、 有染色体重叠的、染色体着色差的或与其它分裂相太靠近的都不要。转
换油镜对选择好的分裂相进行仔细观察。根据ISCN规定，人的46条染 色体中的44条男女共有的常染色体(autosome)，配成2对，分为A B、C、D、E、F、G七个组。另外一对性染色体(sex chromosome).,也 根据形态大小归类，X染色体归到C组。Y染色体归到G组。 1、按显微镜中所看到的图像，在实验报告纸上描术出各垫色体的快 速线条图，在草图中，应保持各染色体的原有方位和相对长度。 2、按各组染色体的特征对染色体进行分组分 仔细地观察中期分裂 相，寻找1、2和3号染色体，并在草图上的染色体旁标上序号。然后找出 B组、G组（包括Y)、F组和D组染色体，并在各染色体旁标上相应的组号， 再进行E组的16、17和18号染色体的识别，最后鉴定出C组染色体，使草 图上每个染色体旁都标有序号或组号。各组染色体的特征（表3-4） 表3-4 人类染色体分组与形态特征 组别染色体编号大小 着丝粒位置 别痕 色 可鉴别程度 见 1-3 最大 中央着丝粒(1、3号)1号可 无 可鉴别 亚中央着丝粒(2号) 无 4-5 次大 亚中央着丝 难鉴别 见 6~12:X 亚中央着丝粒 9号可 无 粒 13-15 中等 近端着丝 难鉴别 16-18 较小 中央着丝粒(16号) 16号可 无 可鉴别 号) 1920 次小 中央着丝 无 难鉴别 粒 21~22:Y 最小 近端着 21、22有难鉴别 Y可见Y无
10 换油镜对选择好的分裂相进行仔细观察。根据 ISCN 规定，人的 46 条染 色体中的 44 条男女共有的常染色体（autosome），配成 22 对，分为 A、 B、C、D、E、F、G 七个组。另外一对性染色体（sex chromosome），也 根据形态大小归类，X 染色体归到 C 组。Y 染色体归到 G 组。 1、按显微镜中所看到的图像，在实验报告纸上描述出各染色体的快 速线条图，在草图中，应保持各染色体的原有方位和相对长度。 2、按各组染色体的特征对染色体进行分组分析。仔细地观察中期分裂 相，寻找 1、2 和 3 号染色体，并在草图上的染色体旁标上序号。然后找出 B 组、G 组（包括 Y）、F 组和 D 组染色体，并在各染色体旁标上相应的组号， 再进行 E 组的 16、17 和 18 号染色体的识别，最后鉴定出 C 组染色体，使草 图上每个染色体旁都标有序号或组号。各组染色体的特征（表 3-4） 表 3-4 人类染色体分组与形态特征 组别 染色体编号 大小 着丝粒位置 副缢痕 随 体 可鉴别程度 A 1～3 最大 中央着丝粒（1、3 号） 1 号可 见 无 可鉴别 亚中央着丝粒（2 号） 无 B 4～5 次大 亚中央着丝 粒 无 难鉴别 C 6～12；X 中等 亚中央着丝粒 9 号可 见 无 难鉴别 D 13～15 中等 近端着丝 粒 有 难鉴别 E 16～18 较小 中央着丝粒(16 号) 16 号可 见 无 可鉴别 亚中央着丝粒（17、18 号） 无 难鉴别 F 19～20 次小 中央着丝 粒 无 难鉴别 G 21～22；Y 最小 近端着丝 粒 21、22 有 难鉴别 Y 可见 Y 无