第七章 附录 一、培养液和常用试剂配制 (一)细胞培养常用试剂 1.RPWI-1640培养液 取RP-1640粉一袋(10.4g),溶于1000L双蒸水中，摇匀，充分 溶解后，取灭菌过滤器过滤，分装在500L葡萄糖瓶中，4℃冰箱保存备用。 (培养液呈玫瑰红色)。 同时可配制使用培养液，配置比例如下： RPMI-1640 8 ml 小牛血清 2 mL pH7.2 0.4 双抗 0.1ml 平均分装于2个链霉素小瓶中，每瓶5 2.Hanks液 原液A: NaCl 160g KCI 8g MgS0. MgClz.6H-O 2g 依次溶于800mL双蒸水中，制备成① CaCl22.8g溶于100mL双蒸水中，制备成② 将①和②液混合后加双蒸水至1000ml,再加氯仿2mL,4℃冰箱保存： 也可不加氯仿，高压灭菌，121℃，15分钟，冷却后放于冰箱保存。 原液B: Na-HPO.12H-O 3.04g KH-PO. 1.2g 葡萄糖 20g 依次溶于800mL双蒸水中，制备成① 酚红0.4g溶于100mL双蒸水中，制备成② 将①和②液混合后加双蒸水至1000m,再加氯仿2mlL,4℃冰箱保存： 也可不加氯仿，高压灭菌，121℃，15分钟，冷却后放于冰箱保存。 使用时按原液A一份，原液B一份和双蒸水18份的比例，配成Hanks 液。将使用也高压灭菌，121℃，15分钟，冷却后放于冰箱保存。 3.D-Hanks液（无钙、镁Hanks液） NaCl 8.0g
第七章 附录 一、培养液和常用试剂配制 （一）细胞培养常用试剂 1. RPMI-1640 培养液 取 RPMI-1640 粉一袋（10.4g），溶于 1000mL 双蒸水中，摇匀，充分 溶解后，取灭菌过滤器过滤，分装在 500 mL 葡萄糖瓶中，4℃冰箱保存备用。 （培养液呈玫瑰红色）。 同时可配制使用培养液，配置比例如下： RPMI-1640 8 mL 小牛血清 2 mL pH 7.2 PHA 0.4 mL 双抗 0.1 mL 平均分装于 2 个链霉素小瓶中，每瓶 5 mL。 2. Hanks 液 原液 A： NaCl 160g KCl 8g MgSO4 2g MgCl2.6H2O 2g 依次溶于 800mL 双蒸水中，制备成① CaCl2 2.8g 溶于 100mL 双蒸水中，制备成② 将①和②液混合后加双蒸水至 1000mL，再加氯仿 2mL，4℃冰箱保存； 也可不加氯仿，高压灭菌，121℃，15 分钟，冷却后放于冰箱保存。 原液 B： Na2HPO4.12H2O 3.04g KH2PO4 1.2g 葡萄糖 20g 依次溶于 800mL 双蒸水中，制备成① 酚红 0.4g 溶于 100mL 双蒸水中，制备成② 将①和②液混合后加双蒸水至 1000mL，再加氯仿 2mL，4℃冰箱保存； 也可不加氯仿，高压灭菌，121℃，15 分钟，冷却后放于冰箱保存。 使用时按原液 A 一份，原液 B 一份和双蒸水 18 份的比例，配成 Hanks 液。将使用也高压灭菌，121℃，15 分钟，冷却后放于冰箱保存。 3. D-Hanks 液（无钙、镁 Hanks 液） NaCl 8.0g
0.4g Na-HPO.12H-0 0.157g KH-PO. 0.06g 葡萄糖 1.0g 依次溶于1000m1双蒸水中，加1%酚红2ml,混匀后高压灭菌(121℃， 15分钟)，冷却后4℃冰箱保存。 4.双抗（青霉素、链霉素 取80万单位青霉素一支，用4ml无菌生理盐水溶解，溶解后吸出1ml 注入到另一支80万单位青霉素中（青霉素已含有100万单位）。取100万 单位链霉素一支，用注射器注入4ml100万单位链霉素混合后，注入95l 生理盐水中，混匀后，即配成了每毫升含青霉素、链霉素各10000单位的双 抗溶液。此液保存在0℃以下冰箱中，可用3个月。注意不要反复动融，以 免降低药效。最好分装成小管保存。 5.0.25%胰蛋白酶溶液 称量250毫克胰蛋白酶，溶于100毫升无钙、镁的Hanks液中，混匀， 过滤除菌后存放在0℃以下冰箱中保存备用。 6.3.8%NaHC03溶液 称3.8 g NaHC03粉末，溶于100ml双蒸水中，混匀后高压灭菌，冷却后 放于冰箱保存。 (二)染色体制备及显带常用试剂 1.肝素溶液 取肝素一支(2ml,12500单位)，加入生理盐水221，即配成了每毫 升含有520单位的肝素使用液。肝素具有抑制细胞分裂的作用，故用量应准 确。 2.秋水仙素 称取4g秋水仙素粉剂，溶于100ml无菌生理盐水中，摇匀溶解，即配 成40μg/m1浓度的秋水仙素使用液。当外周血培养到70小时，每瓶血中加 入两滴。 3.0.025%胰酶(G显带用) 称取25mg胰蛋白酶，溶于100m1无菌生理盐水中，摇匀，置于4℃保 存备用。用前调p值7~7.2。 4.50%硝酸银溶液 称取50g硝酸银粉，溶于100毫升蒸馏水中，待充分溶解后，放进棕 色滴瓶，避光4℃保存备用。 5.Giemsa原液和使用液 量取：Giemsa粉3.8g 甲醇（中性） 375m】 甘油 125ml
KCl 0.4g Na2HPO4.12H2O 0.157g KH2PO4 0.06g 葡萄糖 1.0g 依次溶于 1000ml 双蒸水中，加 1%酚红 2ml,混匀后高压灭菌（121℃， 15 分钟），冷却后 4℃冰箱保存。 4. 双抗（青霉素、链霉素） 取 80 万单位青霉素一支，用 4ml 无菌生理盐水溶解，溶解后吸出 1ml 注入到另一支 80 万单位青霉素中（青霉素已含有 100 万单位）。取 100 万 单位链霉素一支，用注射器注入 4ml 100 万单位链霉素混合后，注入 95ml 生理盐水中，混匀后，即配成了每毫升含青霉素、链霉素各 10000 单位的双 抗溶液。此液保存在 0℃以下冰箱中，可用 3 个月。注意不要反复动融，以 免降低药效。最好分装成小管保存。 5．0.25%胰蛋白酶溶液 称量 250 毫克胰蛋白酶，溶于 100 毫升无钙、镁的 Hanks 液中，混匀， 过滤除菌后存放在 0℃以下冰箱中保存备用。 6．3.8% NaHCO3 溶液 称 3.8g NaHCO3 粉末，溶于 100ml 双蒸水中，混匀后高压灭菌，冷却后 放于冰箱保存。 （二） 染色体制备及显带常用试剂 1. 肝素溶液 取肝素一支（2ml, 12500 单位），加入生理盐水 22ml，即配成了每毫 升含有 520 单位的肝素使用液。肝素具有抑制细胞分裂的作用，故用量应准 确。 2．秋水仙素 称取 4mg 秋水仙素粉剂，溶于 100ml 无菌生理盐水中，摇匀溶解，即配 成 40μg/ml 浓度的秋水仙素使用液。当外周血培养到 70 小时，每瓶血中加 入两滴。 3．0.025%胰酶（G 显带用） 称取 25mg 胰蛋白酶，溶于 100ml 无菌生理盐水中，摇匀，置于 4℃保 存备用。用前调 pH 值 7~7.2。 4． 50% 硝酸银溶液 称取 50g 硝酸银粉，溶于 100 毫升蒸馏水中，待充分溶解后，放进棕 色滴瓶，避光 4℃保存备用。 5．Giemsa 原液和使用液 量取：Giemsa 粉 3.8g 甲醇（中性） 375ml 甘油 125ml
将Giemsa粉溶于少许甲醇中，用研体充分研磨至无颗粒为止，加入全 部甲醇混匀后，加甘油125ml,混匀后放入棕色瓶，置于37℃温箱保存（原 液)。使用前，吸取10mlDH6.8的磷酸盐缓冲液，加入Giemsa原液1ml, 混匀，即配成Giemsa使用液。 6.0.075mol/LKC1低渗液 称取2.79gKC1溶于500ml蒸馏水中，待溶后置于37C温箱保存备用 (三)细菌培养、质粒提取、转化常用试剂 1.LB培养基：将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白陈 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g 如果需要用1 N NaOH(~1ml)调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼 脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。 2.染料：lOmg/ml的溴化乙啶(ethidium bromide): 小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100m1水，用磁力搅拌器 搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。 3.2.5%X-gal(5-溴-4-氯-3-吲1哚-B-半乳糖苷)： 溶解25mg的X-gal于1ml的二甲基甲酰胺(DMF),用铝箔包裹装液管， 贮存于-20℃。 4.1mol/LCaC12溶液 在200ml蒸馏水中溶解54 g CaCiz·620,用0.22μm滤器过滤除菌， 分装成10ml小份贮存于-20℃。 5.TE(用于悬浮和贮存DNA) 成分及终浓度 配制100ml溶液各成分的用量 10mmol/L Tris-HCl 1ml 1mol/L Tris-HC1(pH7.4-8.0,25C) 1mmol/LEDTA 200ul 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 98.8ml 附琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 凝胶浓度(%) 线性DNA长度(bp) 0.5 1000~30000
将 Giemsa 粉溶于少许甲醇中，用研钵充分研磨至无颗粒为止，加入全 部甲醇混匀后，加甘油 125ml，混匀后放入棕色瓶，置于 37℃温箱保存（原 液）。使用前，吸取 10ml pH6.8 的磷酸盐缓冲液，加入 Giemsa 原液 1ml， 混匀，即配成 Giemsa 使用液。 6．0.075mol/L KCl 低渗液 称取 2.79g KCl 溶于 500ml 蒸馏水中，待溶后置于 37℃温箱保存备用。 （三）细菌培养、质粒提取、转化常用试剂 1. LB 培养基：将下列组分溶解在 0.9L 水中： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g 如果需要用 1N NaOH（～1ml）调整 pH 至 7.0，再补足水至 1L。注：琼 脂平板需添加琼脂粉 12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉 7g/L。 2. 染料：10mg/ml 的溴化乙啶（ethidium bromide）： 小心称取 1g 溴化乙锭，转移到广口瓶中，加 100ml 水，用磁力搅拌器 搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于 4℃贮存。 3. 2.5％ X－gal（5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳糖苷）： 溶解 25mg 的 X－gal 于 1ml 的二甲基甲酰胺（DMF）,用铝箔包裹装液管， 贮存于-20℃。 4. 1mol/L CaCl2 溶液 在 200ml 蒸馏水中溶解 54g CaCl2·6H2O，用 0.22μm 滤器过滤除菌， 分装成 10ml 小份贮存于-20℃。 5. TE（用于悬浮和贮存 DNA） 附 琼脂糖凝胶浓度与线性 DNA 分辨范围 成分及终浓度 配制 100ml 溶液各成分的用量 10mmol/L Tris－HCl 1mmol/L EDTA 水 1ml 1mol/L Tris-HCl（pH7.4-8.0，25℃） 200ul 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 98.8ml 凝胶浓度（%） 线性 DNA 长度（bp） 0.5 1000～30000
0.7 800~12000 1.0 500~10000 1.2 400~7000 1.5 200~3000 2.0 50~2000 二、常用缓冲液配制 (一)电泳缓冲液 1.常用的电泳缓冲液 缓冲液 使用液 浓贮存液（每升） Tris-乙酸(TAE)1×:0.04mol/L Tris-乙酸 50×:242 g Tris碱 0.001mol/L EDTA 57.1ml冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸(TBE) 0.5×0.045mo1/L Tris-硼酸 5×:54 g Tris碱 0.001mol/L EDTA 27.5硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) Tris-甘氨酸 1×:25mmol/L Tris 5×:15.1 g Tris 250mmol/L甘氨酸 94g苷氨酸（电泳级）(pH8.3) 0.1%SDS 50ml10%SDS(电泳级) 说明： ①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下 用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。 一般都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电 泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。进行聚丙烯酰胺凝胶垂
二、常用缓冲液配制 （一）电泳缓冲液 1．常用的电泳缓冲液 缓冲液 使用液 浓贮存液（每升） Tris-乙酸（TAE） 1×：0.04mol/L Tris-乙酸 50×：242g Tris 碱 0.001mol/L EDTA 57.1ml 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸（TBE） 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 5×：54g Tris 碱 0.001mol/L EDTA 27.5 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸 1×:25mmol/L Tris 5×:15.1g Tris 250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3） 0.1% SDS 50ml 10% SDS(电泳级) 说明： ① TBE 溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下 用玻璃瓶保存 5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。 一般都以 1×TBE 作为使用液（即 1：5 稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电 泳。但 0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。进行聚丙烯酰胺凝胶垂 0.7 800～12000 1.0 500～10000 1.2 400～7000 1.5 200～3000 2.0 50～2000
直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用 1×TBE以提供足够的缓冲容量。 ②Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2XSDS凝胶加样缓冲液（分离蛋白）： 100mmol/L Tris.HC1(6.8) 200mmo1/L二硫苏糖醇(DTT) 4%SDS(电泳级) 0.2%溴酚蓝 20%甘油 不含DTT的2XSDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取 1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。 2.凝胶加样缓冲液 缓冲液类型 6×缓冲液 贮存温度 0.25%溴酚蓝 1 0.25%二甲苯青FF 4℃ 40%(W/N)蔗糖水溶液 0.25溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 室温 15%聚蔗糖(Fico11400) 0.25%溴酚蓝 Ⅲ 0.25%二甲苯青F℉ 4℃ 30%甘油水溶液 0.25%溴酚蓝 40%(W/N)蔗糖水溶液 4℃ 使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度：确保DA均匀进 入样品孔内：使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。溴酚蓝在琼脂糖 中移动的速率约为二甲苯青F℉的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关
直槽的缓冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用 1×TBE 以提供足够的缓冲容量。 ② Tris-甘氨酸缓冲液用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2×SDS 凝胶加样缓冲液（分离蛋白）： 100mmol/L Tris·HCl(6.8) 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT） 4%SDS（电泳级） 0.2%溴酚蓝 20%甘油 不含 DTT 的 2×SDS 凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取 1mol/L 贮存液现加于上述缓冲液中。 2．凝胶加样缓冲液 缓冲液类型 6×缓冲液 贮存温度 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 4℃ 0.25%二甲苯青 FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25 溴酚蓝 室温 0.25%二甲苯青 FF 15%聚蔗糖(Ficoll400) Ⅲ 0.25%溴酚蓝 4℃ 0.25%二甲苯青 FF 30%甘油水溶液 Ⅳ 0.25%溴酚蓝 4℃ 40%(W/V)蔗糖水溶液 使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；确保 DNA 均匀进 入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。溴酚蓝在琼脂糖 中移动的速率约为二甲苯青 FF 的 2.2 倍，而与琼脂糖浓度无关