第三章染色体制备与分析 实验一大白鼠骨髓细胞染色体的制备及观察 一、目的要求 (1)初步掌握大白鼠骨髓细胞染色体制作方法： (2)熟悉大白鼠染色体特征。 二、实验原理 用适量的秋水仙素溶液注入动物体内，抑制分裂细胞纺锤丝的形成，从 而积累大量的分裂中期的骨髓细胞。通过常规制片方法，观察大白鼠骨髓细 胞的染色体。 三、实验用品 1.材料：小鼠、蟾蜍、大白鼠、家兔染色体制片标本、染色体电视录 像片或勾灯片。 2器材：解剖板、解剖剪、大小镊子、吸管、离心管、注射器、离心 机、培养皿、恒温水浴锅、量筒、预冷载玻片、酒精灯、普通天平、香柏油、 二甲苯、擦镜纸。 3.试剂：200μgml秋水仙素、0.075MKC低渗液、甲醇、冰乙酸、 pH6.8磷酸盐缓冲液、Giemsa原液、生理盐水。 四、内容与方法 1 大白鼠骨髓细胞染色体制备及观察： (1)大白鼠骨髓细胞染色体标本的制备：选择体重在18~20g的健 康大白鼠，在实验前2~3小时，于腹腔注射200μgml秋水仙素（注射量按 2μgml秋水仙素4μgg体重计算)。 1)取材：用颈椎脱白法处死大白鼠，将其置于解剖板上，剪开后肢 皮肤和肌肉，取出完整的股骨（从髋关节至膝关节），然后剔除肌肉、肌腱， 用生理盐水洗净。 2)收集细胞：剪去股骨两头，用注射器针头吸入低渗液约1ml,插 入骨髓腔中，反复冲洗骨髓细胞于刻度离心管中，至骨髓发白为止。然后用
1 第三章 染色体制备与分析 实验一 大白鼠骨髓细胞染色体的制备及观察 一、目的要求 （1） 初步掌握大白鼠骨髓细胞染色体制作方法； （2） 熟悉大白鼠染色体特征。 二、实验原理 用适量的秋水仙素溶液注入动物体内，抑制分裂细胞纺锤丝的形成，从 而积累大量的分裂中期的骨髓细胞。通过常规制片方法，观察大白鼠骨髓细 胞的染色体。 三、实验用品 1. 材料：小鼠、蟾蜍、大白鼠、家兔染色体制片标本、染色体电视录 像片或幻灯片。 2. 器材：解剖板、解剖剪、大小镊子、吸管、离心管、注射器、离心 机、培养皿、恒温水浴锅、量筒、预冷载玻片、酒精灯、普通天平、香柏油、 二甲苯、擦镜纸。 3. 试剂：200μg/ml 秋水仙素、0.075M KCl 低渗液、甲醇、冰乙酸、 pH6.8 磷酸盐缓冲液、Giemsa 原液、生理盐水。 四、内容与方法 1． 大白鼠骨髓细胞染色体制备及观察： （1） 大白鼠骨髓细胞染色体标本的制备：选择体重在 18～20g 的健 康大白鼠，在实验前 2～3 小时，于腹腔注射 200μg/ml 秋水仙素（注射量按 2μg/ml 秋水仙素 4μg/g 体重计算）。 1） 取材：用颈椎脱臼法处死大白鼠，将其置于解剖板上，剪开后肢 皮肤和肌肉，取出完整的股骨（从髋关节至膝关节），然后剔除肌肉、肌腱， 用生理盐水洗净。 2） 收集细胞：剪去股骨两头，用注射器针头吸入低渗液约 1ml，插 入骨髓腔中，反复冲洗骨髓细胞于刻度离心管中，至骨髓发白为止。然后用
吸管吹打骨髓细胞使其分散。 3)低渗处理：假如预热37℃的低渗液至7m1,用吸管轻轻吹打混匀， 置于37℃恒温水浴锅中，保温30分钟后取出，然后加入1ml新配制的甲醇 冰醋酸(3：1固定液)预固定，混匀后以800~1000转/分离心8分钟。 4)固定：弃去上清液。留下沉淀物加入固定液5ml,用吸管吹打混匀， 室温放置30分钟，离心。 5)再固定：方法同4。 6)制备细胞悬液：弃去上清液，留下沉淀物，加入新鲜固定液0.2~ 0.4l(视细胞多少而定)混匀，制成细胞悬液。 7)滴片：用吸管吸取细胞悬液少许，滴在清洁预冷的载玻片上，每 片滴2~3滴（不要重叠），然后顺玻片斜面用口轻轻吹散，晾干或酒精等火 焰干燥。 8)染色：用Giemsa原液和磷酸盐缓冲液(pH6.8)l:9配成Giemsa 染液，在玻片标本上滴几滴Giemsa染液铺匀。染色约为10分钟，倒去染液， 用自来水缓缓冲洗干净，晾干。 (2)观察：将标本细胞面朝上，置于低倍镜下观察，可见有较大的 原形的间期细胞核，寻找染色体分散的中期分裂相，移至视野中央，然后转 换油镜观察。 细胞中染色体的计数：为了避免计数时重复和遗漏，在计数前应先按该 细胞的染色体自然分布状态，大致划分为几个区域，然后按顺序数出各区域 染色体的实际数目，最后加在一起，即为该细胞染色体的总数。大鼠二倍体 细胞染色体数目，2n=42。 2. 实验动物染色体核型的观察 家兔、大白鼠、大。蜍等动物常作为生物学和医学的实验动物，如肿瘤 致畸等都是以动物为模型。因此，医学学生了解这些实验动物的核型非常必 (1)家兔染色体核型：家兔二倍体细胞中染色体，2=44，其雄性染色 体为XY型，雌性为XX型，油镜下可见到细胞中有三种类型的染色体：即 中央着丝粒染色体、亚中着丝粒染色体和近端着丝粒染色体。按照染色体大 小和着丝粒的位置可将染色体分为五组。 组号 染色体号 形态大小 着丝粒位置 A组 1~2 最大 中央 B组 3-8+X 较大 亚中，X在5~6之间 C组 913 中等 9号中央，余为亚中 D组 1417 较小 中央 E组 18~21+y 最小 近端，Y在19~20之间
2 吸管吹打骨髓细胞使其分散。 3） 低渗处理：假如预热 37℃的低渗液至 7ml，用吸管轻轻吹打混匀， 置于 37℃恒温水浴锅中，保温 30 分钟后取出，然后加入 1ml 新配制的甲醇、 冰醋酸（3：1 固定液）预固定，混匀后以 800～1000 转/分离心 8 分钟。 4） 固定：弃去上清液。留下沉淀物加入固定液 5ml，用吸管吹打混匀， 室温放置 30 分钟，离心。 5） 再固定：方法同 4。 6） 制备细胞悬液：弃去上清液，留下沉淀物，加入新鲜固定液 0.2～ 0.4ml（视细胞多少而定）混匀，制成细胞悬液。 7） 滴片：用吸管吸取细胞悬液少许，滴在清洁预冷的载玻片上，每 片滴 2～3 滴（不要重叠），然后顺玻片斜面用口轻轻吹散，晾干或酒精等火 焰干燥。 8） 染色：用 Giemsa 原液和磷酸盐缓冲液（pH6.8）1：9 配成 Giemsa 染液，在玻片标本上滴几滴 Giemsa 染液铺匀。染色约为 10 分钟，倒去染液， 用自来水缓缓冲洗干净，晾干。 （2） 观察：将标本细胞面朝上，置于低倍镜下观察，可见有较大的 原形的间期细胞核，寻找染色体分散的中期分裂相，移至视野中央，然后转 换油镜观察。 细胞中染色体的计数：为了避免计数时重复和遗漏，在计数前应先按该 细胞的染色体自然分布状态，大致划分为几个区域，然后按顺序数出各区域 染色体的实际数目，最后加在一起，即为该细胞染色体的总数。大鼠二倍体 细胞染色体数目，2n=42。 2． 实验动物染色体核型的观察： 家兔、大白鼠、大蟾蜍等动物常作为生物学和医学的实验动物，如肿瘤， 致畸等都是以动物为模型。因此，医学学生了解这些实验动物的核型非常必 要。 （1）家兔染色体核型：家兔二倍体细胞中染色体，2n=44，其雄性染色 体为 XY 型，雌性为 XX 型，油镜下可见到细胞中有三种类型的染色体：即 中央着丝粒染色体、亚中着丝粒染色体和近端着丝粒染色体。按照染色体大 小和着丝粒的位置可将染色体分为五组。 组号 染色体号 形态大小 着丝粒位置 A 组 B 组 C 组 D 组 E 组 1～2 3～8+X 9～13 14～17 18～21+Y 最大 较大 中等 较小 最小 中央 亚中，X 在 5～6 之间 9 号中央，余为亚中 中央 近端，Y 在 19～20 之间
表3-1家免染色体核型分析 (2)大白鼠染色体核型：大白鼠二倍体细胞染色体，2=42，雄性 染色体为XY型，雕性为XX型，油镜下可见到细胞中有三种类型的染色体： 即中央着丝粒染色体、亚中着丝粒染色体和近端着丝粒染色体。按照染色体 大小和着丝粒的位置可将染色体分为四组。 表3-2大白鼠染色体核型分析 组号染色体号形态大小 若丝粒位罔 A组 1-2 最大 1号亚中，2号近端 B组 310+X 较大 3号亚中，余为近端，X在4~5之间 C组 11-18 中等 12、14、18亚中，余为中央 D组 19~20+Y 较小 中央，Y排在19号之前 (3)中华大蟾蜍染色体核型：大蟾蜍二倍体细胞染色体， 2n=22,细胞 中有两种类 型染色体：中央着丝粒染色体和亚中着丝粒染色体。按照染色体大小何着丝 粒位置不同，可将染色体分为四组。 表3-3中华大蟾蜍染色体核型分析 组号染色体号形态大小 着丝粒位置 A组 12 最大 中央 B组 3A-6 较大 3、4为亚中：5、6为中央，6号为中 央6号长臂端部有随体 C组 7~-10 较小 亚中 D组 11 最小 中央 六、作业与思考： 小鼠、家兔、大白鼠、中华大蟾蜍染色体核型有何不同？ (齐冰许风华) 2
3 表 3-1 家兔染色体核型分析 （2）大白鼠染色体核型：大白鼠二倍体细胞染色体，2n=42， 雄性 染色体为 XY 型，雌性为 XX 型，油镜下可见到细胞中有三种类型的染色体： 即中央着丝粒染色体、亚中着丝粒染色体和近端着丝粒染色体。按照染色体 大小和着丝粒的位置可将染色体分为四组。 表 3-2 大白鼠染色体核型分析 （3）中华大蟾蜍染色体核型：大蟾蜍二倍体细胞染色体，2n=22，细胞 中有两种类 型染色体：中央着丝粒染色体和亚中着丝粒染色体。按照染色体大小何着丝 粒位置不同，可将染色体分为四组。 表 3-3 中华大蟾蜍染色体核型分析 六、作业与思考： 小鼠、家兔、大白鼠、中华大蟾蜍染色体核型有何不同？ （齐冰 许风华） 组号 染色体号 形态大小 着丝粒位置 A 组 B 组 C 组 D 组 1～2 3～10+X 11～18 19～20+Y 最大 较大 中等 较小 1 号亚中，2 号近端 3 号亚中，余为近端，X 在 4～5 之间 12、14、18 亚中，余为中央 中央，Y 排在 19 号之前 组号 染色体号 形态大小 着丝粒位置 A 组 B 组 C 组 D 组 1～2 3～6 7～10 11 最大 较大 较小 最小 中央 3、4 为亚中；5、6 为中央，6 号为中 央 6 号长臂端部有随体 亚中 中央
实验二人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本 制备 一、实验目的 1、了解人体外周血淋巴细胞短期培养的原理及方法。 2、初步掌握人外周血淋巴细胞染色体的制备技术。 二、实验原理 健康成年人体内的淋巴细胞总数约有500×10°，其中约有2%在外周血 中循环。在外周血的淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主（每毫升血中的含量可 达13×10个)。在通常情况下，它们都处于间期的G或G期，所以很难 见到正在分裂的淋巴细胞。但是，Nowell(1960)发现，从芸豆(phaseolus vulgaris)中提取的能使红细胞凝集的物质一植物血球凝集素 (phytohemagglutinin,PHA)可以刺激淋巴细胞进行有丝分裂。在PHA的 作用下，处在G期的淋巴细胞可转化成淋巴母细胞，重新进入增殖周期进 行有丝分裂，当体外培养至72小时左右时，大多数淋巴细胞已处于第二增 殖周期内，此时用有丝分裂的阻断剂秋水仙素(colchicine)处理细胞可使 正在分裂的细胞都停止在中期，再经低渗、固定等处理，便可得到较多可供 分析的中期染色体。以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本具有取材方 便，用血量少(0.3~1.0咖1即可)，培养简单等优点，故该方法在临床上 已得到广泛的应用。 三、实验用品 1、器材：超净工作台（或无菌接种箱）、光学显微镜（附照相装置） 隔水式恒温培养箱、干燥箱、水平式离心机、冰箱、恒温水浴箱、高压蒸气 消毒锅、真空泵（或电动吸引器）、10ml刻度离心管、10ml培养瓶（可用 环磷酰胺药瓶代)、2l注射器、吸管、滴管、试管架、三角烧瓶、染色缸、 酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、塘瓷盘、铝制饭盒 消毒用酒精棉球与碘酒棉球等。 2、材料：人外周血 3、试剂：RPMI1640培养液（含1020%小牛血清）、碳酸氢钠(AR)、 PHA、青霉素、链霉素、肝素、5%NaHCO3溶液、lmol/LHC1、三蒸水或双 蒸水、0.075mol/LKC1、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液，pH6.8的磷酸缓冲 液。 4
4 实验二 人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本 制备 一、实验目的 1、了解人体外周血淋巴细胞短期培养的原理及方法。 2、初步掌握人外周血淋巴细胞染色体的制备技术。 二、实验原理 健康成年人体内的淋巴细胞总数约有 500×109，其中约有 2％在外周血 中循环。在外周血的淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主（每毫升血中的含量可 达 1~3×106 个）。在通常情况下，它们都处于间期的 G0 或 G1 期，所以很难 见到正在分裂的淋巴细胞。但是，Nowell（1960）发现，从芸豆（phaseolus vulgaris）中提取的能使红细胞凝集的物质一植物血球凝集素 （phytohemagglutinin，PHA）可以刺激淋巴细胞进行有丝分裂。在 PHA 的 作用下，处在 G0 期的淋巴细胞可转化成淋巴母细胞，重新进入增殖周期进 行有丝分裂，当体外培养至 72 小时左右时，大多数淋巴细胞已处于第二增 殖周期内，此时用有丝分裂的阻断剂秋水仙素（colchicine）处理细胞可使 正在分裂的细胞都停止在中期，再经低渗、固定等处理，便可得到较多可供 分析的中期染色体。以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本具有取材方 便，用血量少（0.3～1.0ml 即可），培养简单等优点，故该方法在临床上 已得到广泛的应用。 三、实验用品 1、器材：超净工作台（或无菌接种箱）、光学显微镜（附照相装置）、 隔水式恒温培养箱、干燥箱、水平式离心机、冰箱、恒温水浴箱、高压蒸气 消毒锅、真空泵（或电动吸引器）、10ml 刻度离心管、10ml 培养瓶（可用 环磷酰胺药瓶代）、2ml 注射器、吸管、滴管、试管架、三角烧瓶、染色缸、 酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、搪瓷盘、铝制饭盒、 消毒用酒精棉球与碘酒棉球等。 2、材料：人外周血 3、试剂：RPMI l640 培养液（含 10~20％小牛血清）、碳酸氢钠（AR）、 PHA、青霉素、链霉素、肝素、5％NaHCO3 溶液、1mol／L HCl、三蒸水或双 蒸水、0.075 mol／L KCl、甲醇、冰乙酸、Giemsa 原液，pH6.8 的磷酸缓冲 液
四、实验内容与方法 (一)器材的清洗 1、培养用瓶的清洗：将培养瓶放入肥皂水中煮沸30分钟，并趁热刷洗 瓶内，然后用自来水将皂液冲净，干后置硫酸一重铬酸钾洗液中浸泡24小 时左右，从洗液中取出的小瓶立即用自来水充分冲洗15次，接着用蒸馏水 冲洗5次，双蒸水神洗3次，然后将小瓶倒立在铝饭盒中，置于烤箱将其烤 干，最后盖上饭盒盖放入高压蒸气消毒锅中灭菌。其它玻璃器皿的清洗消毒 与上述操作基本相同. 2、玻璃除菌滤器的清洗：新购置的玻璃除菌滤器先用肥皂水刷洗并用 自来水冲洗干净：再将滤器安置在抽滤瓶上，倒满浓硫酸后进行抽滤，使浓 硫酸全部通过滤板，然后用蒸馏水多次抽滤，使残留的酸全部除去，再用双 蒸水滤过两次，置110℃烤箱中2小时（温度不要过高：以免使玻璃析出碱 性物质)：取出后用牛皮纸包扎出入口置高压蒸气消毒锅中灭菌。抽滤过不 含血清的培养液的滤器可直接用蒸瘤水油滤洗涤。但油滤讨血清或P阳A的浅 器必须用浓硫酸浸泡一天（将滤器中盛满浓硫酸，不加负压）后，再将剩余 的硫酸抽完，然后用蒸馏水彻底冲洗。 3、橡胶瓶盖的清洗：橡皮塞清洗较简单：可直接放入肥皂水中煮沸30 分钟，然后用自来水充分冲洗，再用蒸溜水煮沸0分钟，取出后用蒸馏水、 双蒸水、各冲洗两次，放入100℃烤箱中烘干，置饭盒中：高压灭菌备用。 4、载波片的清洗：新载玻片先用肥皂水逐一洗一遍，用自来水彻底冲 洗干净，再逐一投入到95%的酒精中浸泡一夜（可在其中长期保存），用 前一小时捞出，然后放入蒸馏水中置入冰箱预冷。 (二)培养液及各种试剂的配制 1.青霉素液： 一瓶80万单位的青霉素，将其溶于40ml双蒸水中，即 成每毫升20000单位的使用液。在培养液中的最终浓度为100单位/ml。 2.链福茶液：取一瓶100万单位的硫酸链霉素粉剂，容于50m1双蒸水 中，即成每毫升20000单位的使用液。在培养液中的最终浓度为100单位/m1。 3.0.075mol1LKC1低渗液： 钾(KCI) 溶于500ml蒸馏水中 4.秋水仙素液：称取秋水仙素5mg溶于100ml0.85NaC1中，配制成50 μg/血l的原液，再用生理盐水稀释成5μg/ml的工作液，然后用G玻璃滤 器除菌，分装成小瓶置4℃冰箱避光。使用时，每5ml培养液用5号针头加 2滴（约0.05ml,相当于205μg),使培养液中秋水仙素的终浓度达0.05 μg/ml左右 5.肝素抗凝剂：肝素注射液1支(12500单位)用25ml灭菌生理盐水 在超净工作台中稀释成500单位/ml的使用液，使用时每毫升血加0.2ml开 素液(100单位肝素液一般可抗凝5ml血)。若购得的肝素为粉剂，可配成 4mg/m1的浓度，由于每毫克含125单位，故浓度也是500单位/ml。 6.pH6.8磷酸缓冲液：称取NaP0,.12H011.8g(或5.92g
5 四、实验内容与方法 （一）器材的清洗 1、培养用瓶的清洗：将培养瓶放入肥皂水中煮沸 30 分钟，并趁热刷洗 瓶内，然后用自来水将皂液冲净，干后置硫酸一重铬酸钾洗液中浸泡 24 小 时左右，从洗液中取出的小瓶立即用自来水充分冲洗 15 次，接着用蒸馏水 冲洗 5 次，双蒸水冲洗 3 次，然后将小瓶倒立在铝饭盒中，置于烤箱将其烤 干，最后盖上饭盒盖放入高压蒸气消毒锅中灭菌。其它玻璃器皿的清洗消毒 与上述操作基本相同． 2、玻璃除菌滤器的清洗：新购置的玻璃除菌滤器先用肥皂水刷洗并用 自来水冲洗干净；再将滤器安置在抽滤瓶上，倒满浓硫酸后进行抽滤，使浓 硫酸全部通过滤板，然后用蒸馏水多次抽滤，使残留的酸全部除去，再用双 蒸水滤过两次，置 110℃烤箱中 2 小时（温度不要过高；以免使玻璃析出碱 性物质）；取出后用牛皮纸包扎出入口置高压蒸气消毒锅中灭菌。抽滤过不 含血清的培养液的滤器可直接用蒸馏水抽滤洗涤。但抽滤过血清或 PHA 的滤 器必须用浓硫酸浸泡一天（将滤器中盛满浓硫酸，不加负压）后，再将剩余 的硫酸抽完，然后用蒸馏水彻底冲洗。 3、橡胶瓶盖的清洗：橡皮塞清洗较简单；可直接放入肥皂水中煮沸 30 分钟，然后用自来水充分冲洗， 再用蒸溜水煮沸 30 分钟，取出后用蒸馏水、 双蒸水、各冲洗两次，放入 100℃烤箱中烘干，置饭盒中；高压灭菌备用。 4、载波片的清洗：新载玻片先用肥皂水逐一洗一遍，用自来水彻底冲 洗干净，再逐一投入到 95％的酒精中浸泡一夜（可在其中长期保存），用 前一小时捞出，然后放入蒸馏水中置入冰箱预冷。 （二）培养液及各种试剂的配制 1.青霉素液：取一瓶 80 万单位的青霉素，将其溶于 40ml 双蒸水中，即 成每毫升 20000 单位的使用液。在培养液中的最终浓度为 100 单位/ml。 2.链霉素液：取一瓶 100 万单位的硫酸链霉素粉剂，溶于 50ml 双蒸水 中，即成每毫升20000单位的使用液。在培养液中的最终浓度为100单位/ml。 3. 0．075 mol/ . L KCl 低渗液： 氯化钾（KCl） 2．79g 溶于 500ml 蒸馏水中。 4.秋水仙素液：称取秋水仙素 5mg 溶于 100ml 0.85NaCl 中，配制成 50 μg/ml 的原液，再用生理盐水稀释成 5μg/ml 的工作液，然后用 G5 玻璃滤 器除菌，分装成小瓶置 4 0 C 冰箱避光。使用时，每 5ml 培养液用 5 号针头加 2 滴（约 0.05ml，相当于 205μg），使培养液中秋水仙素的终浓度达 0.05 μg/ml 左右。 5. 肝素抗凝剂：肝素注射液 1 支（12500 单位）用 25ml 灭菌生理盐水 在超净工作台中稀释成 500 单位/ml 的使用液，使用时每毫升血加 0.2ml 肝 素液（100 单位肝素液一般可抗凝 5ml 血）。若购得的肝素为粉剂，可配成 4mg/ml 的浓度，由于每毫克含 125 单位，故浓度也是 500 单位/ml。 6. pH6.8 磷 酸 缓 冲 液 ： 称 取 Na2HPO4 .12H20 11.8g （ 或 5.92g